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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组全长约15kb,包括九个开放阅读框(ORFs)。由PRRSV所引起的猪繁殖与呼吸综合征自报道以来,已经对养猪业造成了重大经济损失。微小核糖核酸(miRNAs)是一类长度为18-23bp的非编码RNA,可作为一种调控物质在转录后水平广泛参与调控机体生长、发育等多种生命过程。PRRSV的遗传多样性等特点使得传统疫苗的交叉保护力不足,为PRRS的防治带来了不小的困难。而随着研究的深入,越来越多的miRNA被发现具有抗病毒功能,并且miRNA可直接针对病毒基因保守区域发挥作用,因此对不同毒株均具有抗病毒作用。本研究以PRRSV的全基因组为模板,希望筛选到能显著抑制PRRSV在细胞内增殖的miRNA,从而为PRRS的防治提供新的依据。研究内容包括以下几个方面：1.可能作用于PRRSV基因组的miRNA的预测和报告质粒的构建本研究以PRRSV WuH3株全基因组为模板,将其提交到在线分析软件Targetscan,根据miRNA与靶基因的结合特点选择了63条可能作用于PRRSV基因组的miRNA,由公司直接合成模拟物。同时,将PRRSV WuH3株ORFs克隆到载体pMIR-report上,成功构建报告质粒pMIR-WUH3-ORFs。2.抑制PRRSV增殖的miRNA的筛选将合成的miRNA模拟物与各报告质粒分别共转染HEK-293细胞,利用双荧光素酶系统检测发现miR-let-7g/7a、 miR-3125、 miR-379、 miR-3165和miR-127-3p共6条miRNA分别能显著抑制报告质粒pMIR-WUH3-NSP2、 pMIR-WUH3-ORF5、 pMIR-WUH3-3’UTR、 pMIR-WUH3-5’UTR pMIR-WUH3-ORF2a/2b的活性。其中niR-let-7g和miR-3125分别能靶向PRRSV NSP2第2037-2061bp和ORF5第14104-14136bp的两个保守区域。并且进一步通过Western-blot和空斑实验证实miR-let-7g和miR-3125显著抑制PRRSV在Marc-145细胞中的增殖。3.miR-let-7g和miR-3125不调控IFN-p的表达为了探究miR-let-7g和miR-3125是否能调控IFN-β的表达,将miR-let-7g和miR-3125的模拟物和IFN-β启动子荧光素酶报告质粒分别共转染HEK-293细胞,双荧光素酶系统检测结果表明niR-let-7g和miR-3125不能激活IFN-β启动子活性；进一步检测了niR-let-7g和miR-3125转染细胞后上清对VSV-GFP增值的影响,结果显示VSV-GFP增值滴度无显著变化,说明niR-let-7g和miR-3125不能促进IFN-β的分泌,以上结果说明miR-let-7g和miR-3125不参与调控IFN-p的表达。4.PRRSV感染抑制miR-let-7g和miR-3125的表达为了探究miR-let-7g和miR-3125的表达是否受PRRSV感染的调控,本研究利用荧光定量RT-PCR检测PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间点细胞内miR-let-7g和miR-3125的表达量,结果显示PRRSV感染Marc-145的前12h细胞内miR-let-7g和miR-3125的表达显著降低,miR-let-7g表达量在PRRSV感染36h后恢复到和对照组一致,miR-3125的表达量则在PRRSV感染24h后显著高于对照组。以上结果说明在感染PRRSV早期细胞内miR-let-7g和miR-3125的表达受到显著抑制。