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有机磷农药的广泛使用甚至滥用对生态环境和人类身体健康构成了严重威胁。微生物可以通过自产的有机磷水解酶催化有机磷农药的磷酯键断裂,生成低毒性产物,具有降解效率高、条件温和、价格低廉等优点,显示出了良好的应用前景。本文研究了携带质粒pETDuet-opd-bl的E.coliBL-21(DE3)产有机磷水解酶的发酵工艺。在摇瓶水平上通过响应面分析法优化了培养基组成和培养条件,在此基础上对有机磷水解酶进行了酶学性质研究,最后对大肠杆菌产有机磷水解酶进行了放大发酵研究,并且探索了优化的发酵工艺对于降低发酵废液COD的效果。其主要研究内容和结果为:(1)选择影响有机磷水解酶酶活的8个因素(碳源、氮源、磷酸盐、乳糖浓度、乳糖添加时间、初始pH、接种量、金属离子)进行了E.coliBL-21(DE3)产有机磷水解酶的单因素优化试验。通过Plackett-Burman(PB)试验筛选,得出酵母粉浓度、乳糖浓度和钴离子浓度是影响有机磷水解酶酶活的显著因素。通过最陡爬坡试验和基于Box-Behnke试验的响应面优化,确定了最终发酵培养基为:酵母粉浓度17.35g/L,钴离子浓度0.24mmol/L,乳糖浓度11.30g/L、乳糖添加时间8 h,麦芽糖浓度6 g/L,磷酸盐浓度0.1 mol/L,pH 7.0,接种量4%。培养基组分与条件的优化使得有机磷水解酶酶活从10000 U/mL提高到了 21237 U/mL。(2)研究了有机磷水解酶的若干酶学性质,结果表明有机磷水解酶对甲基对硫磷的米氏常数Km为0.0207mmol/L,Vmax为23674μmol/min·mL,粗酶的酶活为320U/mg。通过对酶学性质的研究得到了有机磷水解酶的最适反应条件为:最适反应的pH为8.5,在pH 7.5-9.5的范围内酶的相对活性均在70%以上,偏碱性条件下酶活相对比较稳定,活性损失较少;最适的反应温度为30℃,酶的高温耐受性相对较差,温度应不超过40℃;Co2+、Cu2+金属离子对水解酶有激活作用,加入0.]mmol/L钴铜金属离子分别使酶的活性提高了 20%和10%,Ca2+、Mg2+对水解酶活性有强烈的抑制作用,加入这些离子酶活性大大降低;对于酶样品的长期保存,在4℃下保存的有机磷水解酶稳定性最好,保存一个月仍然有73%的初始酶活。(3)开展了 7L和500L发酵罐的放大发酵试验,得到了 7L发酵罐水平上最终的优化条件为30℃进行诱导前培养,25℃诱导产酶,通气量3 L/min,搅拌转速200r/min。在这些条件下,菌体生长量OD600可达到7.76,酶活可达到了 33000 U/mL左右。进行了 500 L发酵罐水平上的放大验证,菌体生长量OD600可达到15.87,酶活达到了33200U/mL。所有发酵批次中,在最佳条件下进行7L小试发酵得到的发酵废液COD含量为7500 mg/L,与空白对照相比降低了 4.87倍。而在最佳条件下进行500 L中试发酵得到的发酵废液COD含量为11700 mg/L,与空白对照相比降低了 3.63倍。在保证高酶活的同时,降低了 COD含量,减轻了后续发酵废液处理压力,为有机磷水解酶的进一步产业化应用提供了有力支持。