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肝纤维化(liver fibrosis/hepatic fibrosis)是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径,虽是可逆的病理过程,但治疗上仍缺乏有效、副作用小的药物。导师李佃贵教授首创了中医“浊毒”理论,他经多年临证认为,浊毒内蕴是肝纤维化的主要病机之一。以化浊解毒法为指导,选用中药组成化浊解毒方治疗肝纤维化取得了满意的疗效,但其治疗机制尚未明确。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)作为成纤维细胞/肌成纤维细胞的主要来源,是肝纤维化发生发展的中心环节,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成与降解失衡是肝纤维化的主要病理改变。多种细胞因子、生长因子、趋化因子是肝纤维化的关键因子,多条信号通路参与了肝纤维化的调控过程,它们被确认为肝纤维化形成的重要靶点。本论文分三个部分,从体内、体外不同水平上选取部分关键靶点,观察了化浊解毒方抗肝纤维化的作用和机制,为化浊解毒法和“浊毒”理论治疗肝纤维化提供了依据。第一部分化浊解毒方经JAK/STAT通路抑制DMN致大鼠肝纤维化的作用研究目的:通过观察化浊解毒法组方对二甲基亚硝胺(DMN)致大鼠肝纤维化模型中肝组织Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ) mRNA以及JAK2/STAT3蛋白的表达情况,评价化浊解毒方对大鼠肝纤维化的调节作用,探讨其可能的作用机制。方法:清洁级SD雄性大鼠70只,分为4组,即:正常对照组(A组)、模型对照组(B组)、复方鳖甲软肝片组(C组)、化浊解毒方组(分为等效、二倍、四倍剂量组,即D1、D2、D3组)、,除A组外,各组均予1%DMN10mg/kg腹腔内注射,实验第1周连续造模3天,第2到6周,每周连续造模2天,第5到8周,每天等体积灌胃给与不同药物。第8周末处死大鼠并取新鲜肝组织,用Masson染色观察肝组织病理情况;运用RT-PCR法检测肝组织中ColⅠ、ColⅢmRNA的表达;用Western-blot法检测JAK2/STAT3蛋白表达情况。结果:1肝组织及病理学情况观察:肉眼观察A组大鼠肝脏表面光滑、质韧,色鲜红;B组大鼠肝脏表面有颗粒状结节,质硬;D2组受试大鼠肝脏表面散在细砂粒样结节,质稍硬,色暗红。Masson染色情况显示:A组大鼠肝小叶结构完整,肝索排列整齐;B组纤维纵膈较多,纤维组织增粗、包绕肝小叶;D1、D2和C组纤维纵膈均较B组减轻,纤维条索变细;D3组纤维条索较粗。2化浊解毒方对大鼠肝组织中ColⅠ、Col ⅢmRNA表达的影响:与A组相比,B组ColⅠ、Col Ⅲ表达均明显增多(P <0.01)。与B组相比, C及D1组ColⅠ、Col Ⅲ表达均降低(P <0.05);D2组ColⅠ、Col Ⅲ表达显著降低(P <0.01);D3组ColⅠ、Col Ⅲ表达降低不明显(P>0.05)。3化浊解毒方对大鼠肝组织中JAK2、STAT3蛋白表达的影响:与A组相比,B组JAK2、STAT3蛋白表达均明显增多(P <0.01)。与B组相比,D1组JAK2蛋白表达降低(P <0.05);C、D2组JAK2蛋白表达显著降低(P <0.01);除C组外,各给药组STAT3蛋白表达较B组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:化浊解毒方能够改善DMN致大鼠肝纤维化的程度,可以不同程度的改善肝纤维化大鼠肝组织ColⅠ、ColⅢ的情况,以二倍剂量效果最为明显。通过降低JAK2蛋白表达,从而调节JAK2/STAT3通路,可能是其发挥抗肝纤维化的作用机制之一。第二部分化浊解毒方调节PDGF、CTGF、MCP-1和IL-13抑制DMN致大鼠肝纤维化的作用研究目的:通过观察以化浊解毒法组方对DMN致大鼠肝纤维化模型中肝组织血管内皮生长因子-BB(PDGF-BB)、血清中转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-13(IL-13)含量的影响,探讨化浊解毒方经细胞因子抗肝纤维化的作用和机制。方法:运用RT-PCR法检测肝组织中PDGF-BB mRNA的表达,运用ELISA法检测大鼠血清中CTGF、MCP-1、IL-13的含量。结果:1化浊解毒方对大鼠肝组织PDGF-BB mRNA表达的影响:与A组比较,B组PDGF-BB mRNA的表达显著增加(P <0.01);与B组比较,C、D1组PDGF-BB mRNA表达均降低(P <0.05);D2组的PDGF-BB mRNA降低更为显著(P <0.01);D3组与B组PDGF-BB mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05);D3组PDGF-BB mRNA的表达较D2组显著升高(P <0.01)。2化浊解毒方对大鼠血清中CTGF含量的影响:与A组相比,B组CTGF含量增多(P <0.05);与B组相比,各给药组大鼠血清CTGF含量均降低(P <0.05);与C组相比,D3组含量有增多趋势,但无统计学意义(P=0.063>0.05);D2组CTGF含量较C组、D1、D3组均降低(P <0.05)。3化浊解毒方对大鼠血清中MCP-1含量的影响:与A组相比,B组MCP-1表达明显增多(P <0.01);与B相比,除D3组外(P>0.05),各治疗组MCP-1含量均明显降低(P <0.01);C组MCP-1含量较D1、D3组降低(P <0.01,P <0.05)。4化浊解毒方对大鼠血清中IL-13含量的影响:与A组相比,B组IL-13含量明显增多(P <0.01);与B组相比,各给药组大鼠血清IL-13含量均明显降低(P <0.01);C组IL-13含量较D3组显著降低(P <0.01);D2组IL-13含量与D1、D3组相比显著降低(P <0.01,P <0.05)。结论:化浊解毒方可减少DMN致肝纤维化大鼠肝组织中PDGF-BB的表达及血清中CTGF、MCP-1、IL-13的含量,推测上述细胞因子是化浊解毒方抗肝纤维化的作用靶点之一。第三部分化浊解毒方含药血清经MAPK及PI3K/AKT通路抑制大鼠HSC活化的作用研究目的:运用血清药理学方法观察大鼠HSC中p-p38、p-JNK、PI3K及p-AKT蛋白的表达,评价化浊解毒方大鼠含药血清对MAPK、PI3K/AKT信号转导通路的作用,探讨化浊解毒方抗肝纤维化可能的分子水平作用机制。方法:选取健康成年雄性SD大鼠,按分组要求灌胃给予相应药物10天后制备含药血清,分为:正常对照组(A组)、模型对照组(B组)、阳性对照组(C组)、化浊解毒方含药血清等效剂量(D1)和二倍剂量(D2)组,B、C、D1、D2组均先行加入TGF-β1干预。各组加入相应血清培养48h后,利用Western-blot法检测p-p38、p-JNK、PI3K及p-AKT蛋白的表达。结果:1p-p38蛋白的表达:与A组比较,B组p-p38蛋白的表达明显增强(P <0.05);与B组比较,各给药组p-p38蛋白表达显著降低(P <0.05);与C组比较,D1组p-p38蛋白表达有增高趋势,但差异无统计学意义(P=0.051>0.05),D2组较C组及D1组p-p38蛋白表达均降低(P <0.05)。2p-JNK蛋白的表达:与A组比较,B组p-JNK蛋白的表达增强(P <0.05);与B组比较,各给药组p-JNK蛋白的表达降低(P <0.05)。与C组比较,D1、D2组p-JNK蛋白的表达均降低(P <0.05);D2组p-JNK蛋白的表达低于D1组(P <0.05)。3PI3K蛋白的表达:与A组比较,各受试组PI3K蛋白表达均升高(P<0.05);与B组比较,D2组PI3K蛋白表达显著降低(P <0.01);D2组PI3K蛋白表达低于C组和D1组(P <0.05)。4p-AKT蛋白的表达:与A组比较,各受试组p-AKT蛋白的表达升高(P <0.05);各给药组p-AKT蛋白表达均较B组降低,差异有统计学意义(P <0.05),其中D2组差异有显著性(P <0.01);D2与D1组比较,p-AKT蛋白表达降低,(P <0.05)。结论:化浊解毒方含药血清能够降低p-p38、p-JNK、PI3K、p-AKT蛋白在TGF-β1诱导的HSC中的表达,从而调控p38、JNK及PI3K/AKT信号通路的传导,推测化浊解毒方发挥抗肝纤维化的分子水平作用机制与调节MAPK及PI3K/AKT信号通路有关。