基于蛋白质组学研究不同妊娠期饲养环境对子代行为和脑神经发育影响

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在集约化养猪业中,妊娠母猪会受到空间限制、限饲、社会隔离、混群和运输等不同程度的应激,这些难免会对其仔猪的生理、行为、健康和生长发育产生消极影响。但缺乏其中潜在机理的研究,因此,本研究从行为、生理免疫和脑神经发育角度出发,从分子调控的水平探究不同妊娠期饲养环境对母猪后代(仔猪)的影响。试验一:为比较妊娠期限位栏饲养及群养母猪的繁殖性能和应激水平,本试验选择了20头体况相近的初产妊娠母猪作为试验对象,统计母猪的妊娠期第25天、45天、65天、85天和105天时无食咀嚼行为发生的次数。在妊娠期的五个时间段:21-25天、41-45天、61-65天、81-85天和101-105天,分别连续采集各阶段母猪的唾液样本,并将各组每个阶段的所有唾液混样,检测母猪应激指标,包括皮质醇(Cortisol)、分泌型免疫球蛋白(SIg A)和唾液淀粉酶(AMY)水平。此外,在妊娠期25天、45天、65天、85天和105天时采集母猪的血清样本用于检测IFN-γ、IL-6、多巴胺(DA)、Cortisol和神经营养因子(BDNF)的含量。结果显示,随着妊娠时间增长,限位及群养母猪无食咀嚼行为的发生频率均呈显著上升的趋势,但差异不显著(P>0.05)。与群养母猪相比,限位母猪在65天、85天和105天时无食咀嚼行为的发生频率显著升高(P<0.05)。与群养母猪相比,限位栏母猪的唾液AMY活性在65天、85天和105天显著降低(P<0.05),血清Cortisol水平在65天和85天显著升高(P<0.05),DA含量在所有时间点均显著降低(P<0.05),IL-6含量在85天和105天显著降低(P<0.05)。试验二:为研究不同妊娠期饲养环境对母猪子代(仔猪)行为和脑神经发育的影响。本试验随机挑选32头限位母猪后代(CC组)和群养母猪后代(GP组)(n=16)作为试验对象,断奶当天(28日龄)对其进行高架十字迷宫(EPM)测试,并对血清中的IFN-γ、IL-6、Ig A、DA、Cortisol和BDNF的含量进行检测。断奶后14天(42日龄)进行屠宰,并收集脑组织(海马、前额叶皮质、杏仁核、伏隔核和下丘脑)样本。对海马和前额叶皮质进行形态学检测。对海马进行蛋白质组学测序。对脑组织进行神经递质(5-HT、β-EP、DA、NE、E、Gly、Glu和Asp)检测。用实时荧光定量PCR对脑组织的神经发育相关基因(BDNF、CREB、Trk B、NGF、SYP、PSD-95、NR2A、TPH1、TPH2、SLC6A4、MAOA、HTR1A、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR6和HTR7)进行检测。结果显示,GP组和CC组仔猪在EPM测试中的行为表现无明显差异(P>0.05);生理免疫结果显示,与GP组相比,CC组血清中IFN-γ含量极显著升高(P<0.01),DA浓度极显著降低(P<0.01);形态学结果发现CC组海马和前额叶皮质细胞胞体皱缩,出现染色质浓染和髓鞘板松解现象。海马蛋白质组学结果显示,组间共有194个差异蛋白,包括73个上调和121个下调蛋白(|log2Fold Change|>1,P<0.05)。GO富集分析差异蛋白的功能主要与氧化应激、炎症反应、免疫应答和神经发育等相关。KEGG分析差异蛋白中参与的代谢途径和信号通路主要包括NF-κB通路和B细胞受体通路等。对GO富集的差异蛋白进行功能分类,并筛选出12个与炎症反应和神经发育相关的候选蛋白,利用q RT-PCR验证(CP4F6、PTN、PZP、MALT1、HMGB3、PDIA3、CAP1、NFH和WFS1)和Western Blot验证(TAU、VACM1、VIME和AIM),验证结果与蛋白质组学结果相符。对KEGG富集的NF-κB通路利用q RT-PCR检测该通路的关键基因(NF-κB、I-κB-α、I-κK-β、i NOS、COX-2、PTGEs、IL-1β、IL-6和IFN-γ),Western Blot检测关键节点蛋白(NF-κB、P-NF-κB、IKK、IKB和TNF-α),结果表明该通路被激活。神经递质含量结果显示,与GP组相比,CC组海马中β-EP和γ-GABA的浓度显著降低(P<0.05),NE和E的浓度极显著降低(P<0.01),Glu浓度显著升高(P<0.05),5-HT含量变化在下丘脑、海马、杏仁核、前额叶皮质和伏隔核中均显著降低(P<0.05);神经发育相关基因的检测发现,与GP组相比,CC组仔猪海马中SYP的表达显著下降(P<0.05),MAOA和HTR1A的表达显著升高(P<0.05)。结论:妊娠期母猪限位栏饲养会引起子代的炎症反应,破坏仔猪海马神经元结构,影响仔猪海马中氧化应激、免疫应答及神经发育相关蛋白的表达。NF-κB信号通路参与了产前应激对仔猪脑神经免疫功能的调节。
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