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促进外源治疗基因定点整合至宿主基因组，既能克服随机插入所导致的功能基因断裂、原癌基因激活、染色体缺失、重排等潜在危险，又可以达到使治疗基因长期表达的目的，是较为理想的基因治疗策略。腺相关病毒是一种非致病性的细小病毒，因其具有将自身基因组定点整合至人类染色体的特性，已被发展为基因治疗载体用于许多疾病的治疗。腺相关病毒的整合机制可以用于指导外源基因定点整合至人类基因组19号染色体特定区域(19q13．3-qter)：AAVSl位点，因此对腺相关病毒的整合机制的研究也具有重要的意义。目前已知腺相关病毒的Rep68／78蛋白为介导定点整合所必需，而病毒基因组中所需的与整合相关的核心顺式元件尚无定论。普遍认为ITR是腺相关病毒整合所需顺式元件，近年来有研究表明P5整合效率元件(P5IEE)也可介导质粒发生依赖于Rep蛋白的高效定点整合。
我们以EGFP和Neo基因为报告基因构建了一系列携带不同整合顺式元件的质粒，与rep基因表达质粒共转染293细胞后，通过对细胞克隆形成效率及基因组整合位点的Southernblot检测来确定腺相关病毒定点整合系统的核心顺式元件。我们发现在Rep蛋白存在的情况下，16bp的RBE元件即可以介导质粒发生针对AAVSl位点的整合，并且位于ITR内的RBE(rrR)元件比位于P5IEE内的RBE(p5)元件具有更高的效率及位点专一性，这一发现提示了RBE很可能是腺相关病毒具有定点整合能力的根本原因。对P5整合效率元件(P5IEE)的缺失分析表明随着P5IEE从5’端逐渐缺失，介导克隆形成和定点整合的效率都有所下降，尤其是前89bp缺失后介导克隆形成效率与完整的P5IEE相比出现显著差异，介导整合的特异性也明显下降，说明P5IEE中前89bp中具有与整合相关的结构或序列。对整合质粒与基因组接合区序列特征的分析表明质粒断裂部位多位于RBE序列附近；部分质粒与基因组接合点附近插入了不同长度的未知DNA序列。这些结构特征与野生型腺相关病毒整合至基因组时的序列特征相似，说明RBE顺式元件所介导的质粒定点整合与野生型腺相关病毒整合是通过同一套整合机制。
为了进一步在活体实验中探讨是否可以通过此定点整合系统使治疗基因定点整合至小鼠基因组内，长期表达功能蛋白，我们以凝血因子IX(hFIX)为报告基因构建了携带整合顺式元件ITRRBE的质粒，通过尾静脉液压法将此质粒与rep基因表达质粒一起导入携带AAVSl的转基因小鼠体内。质粒pRBE—CMVhFIX与rep基因表达质粒共注射后hFIX在小鼠体内高水平表达，l天时hFIX表达水平为2588~203ng／m1血浆，此后开始逐渐下降，80d后稳定在150～204ng向l水平，持续时间超过240天；与不携带任何整合元件的对照质粒pN2一CMVhFIX相比，对照组起初同样得到高水平的hFIX表达，之后迅速下降，150天后血浆中已基本检测不到hFIX蛋白。PCR的结果显示DNA注射后1天hFIXDNA在多组织中都有分布；30天时观察到对照组外源DNA丢失的速度要高于pRBE—CMVhFIX注射组，除了肝脏外，其余器官hFIX信号均已大幅度减弱；240d时对照组所有器官中都检测不到hFIXDNA特异带，而pRBE-CMVhFIX注射组在心、肝、肾中仍能检测到hFIXDNA。对各组织RT一PCR的检测反映hFIX主要在小鼠肝脏中长期表达，时间超过240天。谷草及谷丙转氨酶水平与病理切片检测表明除尾静脉液压法造成的短期急性肝损伤现象以外没有观察到Rep蛋白引起另外的细胞毒性。
本研究首次发现并证实了在Rep蛋白存在的情况下，16bp的RBE元件即可以介导质粒发生针对AAVSl位点的整合，并且揭示了该整合方式下质粒与基因组接合区序列特征，这些发现提示RBE很可能是腺相关病毒具有定点整合能力的根本原因，为现有的腺相关病毒位点特异整合分子机制提供了有力的补充，也为高效定点整合载体的设计提供了新的思路；在动物活体实验中，我们证明此系统可以介导hFIX在携带AAVSl的转基因小鼠体内长期存在及稳定表达，为将来基于AAV的定点整合系统在基因治疗领域的应用提供了参考。