论文部分内容阅读
T细胞根据其所表达的T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)不同可以分为两个亚群，αβT细胞和γδT细胞。γδT细胞是T淋巴细胞中的一个特殊群体，构成γδTCR的两条多肽链是γ链和δ链，并与CD3分子以非共价键相连。γδT细胞发育早于αβT细胞，主要分布于小肠、皮肤、肺及生殖器官等黏膜及皮下组织。在人外周血中γδT细胞占CD3+T细胞的1％～5％，其中Vγ9Vδ2T细胞是外周血γδT细胞中的主要亚型。 γδT细胞识别的抗原种类多样，包括肽类、脂类抗原、小分子磷酸盐抗原等，γδTCR能以MHC非限制性方式直接识别抗原。人类γδT细胞主要识别两类配体，一类是应激诱导的和异位表达的蛋白类抗原如MHC-Ⅰ类链相关抗原A和B(MHC ClassⅠ-Related Chains A and B，MICA/B)、热休克蛋白(Heat shock protein,HSPs)、UL16结合蛋白(UL-16binding proteins，ULBPs);另一类是微生物和真核细胞来源的非肽类双磷酸盐抗原，例如异戊烯基二磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）。γδT细胞能在体外对多种肿瘤细胞系产生细胞毒活性，是很有希望的肿瘤免疫治疗的候选细胞之一。但由于已鉴定的γδT细胞识别的肿瘤相关抗原配体较少，γδT细胞具体的抗原识别及效应机制尚不明确，这已成为制约其研究和应用的瓶颈。 研究发现在γδTCR识别抗原的过程中，δ链的互补决定区3（Complementary determining region3，CDR3）起着关键作用，决定了识别的特异性。本课题组前期使用卵巢上皮癌(ovarian epithelial carcinoma，OEC)中来源于肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrate lymphocyte，TIL)的TCRVδ2CDR3序列合成CDR3δ肽，并证明CDR3δ肽可特异性结合肿瘤细胞系和肿瘤组织，表明CDR3δ在抗原结合中的决定性作用，并采用基于CDR3δ肽结合特性的筛选策略，成功筛选到Vδ2TCR识别的肿瘤相关抗原MutS2同源蛋白2（Human MutS homologue2，hMSH2）。hMSH2分子属于应激类蛋白配体，是DNA错配修复系统的一个重要成员。膜异位表达的hMSH2分子被TCRγδ和NK细胞受体成员2D(NKG2D)双重识别后，参与介导γδT细胞对靶细胞的杀伤或清除作用。本研究经以前期充分验证的具有肿瘤结合特异性的CDR3δ序列合成CDR3δ探针肽OT1、OT3和OT10，筛选人类蛋白质组芯片，希望能找到更多的功能性的γδT细胞识别的肿瘤相关抗原，为揭示γδT细胞的抗肿瘤机制奠定基础。 蛋白质组芯片筛选结果显示，与CDR3δ肽结合的候选蛋白配体共9种，分别是与OT1探针结合的PHF21A、LDB3、SYF2和PPP1R14A，与OT3探针结合的AGR2、TGM1、SMAD7和ACADVL以及与OT10探针结合的SYAP1:通过对相关数据库查询和蛋白的功能进行分析，发现与OT3CDR3δ合成肽特异性结合的AGR2蛋白是蛋白质二硫键异构酶(Protein disulphide isomerase，PDI)家族的成员，参与调节内质网应激，在人类大多数转移性腺癌（例如乳腺癌，胰腺癌，食管癌，肝癌，肺癌和结肠癌）中升高，与肿瘤的发生和转移密切相关。因此，进一步对AGR2蛋白在正常细胞和肿瘤细胞的表达特点进行研究很有必要。 构建原核表达载体重组表达并纯化GST-AGR2融合蛋白，固相化包被GST-AGR2融合蛋白，ELISA结果显示其能特异性地结合CDR3δ肽OT3，具有剂量依赖性;以固相化包被GST-AGR2，从人外周血单个核细胞中扩增γδT细胞，能显著促进γδT细胞活化相关分子CD69和CD25的表达(*P＜0.05)，但不能有效促进γδT细胞增殖。使用流式细胞术检测几种常用的人乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-231和SK-Br-3)细胞和以及人结肠癌细胞系HT-29细胞内AGR2分子的表达水平，结果发现，不同肿瘤细胞内AGR2的表达情水平不同。在MCF-7和HT-29细胞中表达较高，胞内染色阳性者达到80％，在MDA-MB-231和SK-Br-3细胞中相对较低，胞内染色阳性者为30％左右，而在健康人外周血PBMC中几乎不表达;选用AGR2表达较高的MCF-7细胞作为靶细胞，乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)释放法检测GST-AGR2对γδT细胞细胞毒活性的作用，结果显示与GST-AGR2预孵育能在体外显著促进γδT细胞对乳腺癌肿瘤细胞系MCF-7的细胞毒作用（**P＜0.01），这可能与GST-AGR2可提升表达CD69或TNF-α的γδT细胞比例有关联。 综上，本研究得出以下结论:表达于多种肿瘤细胞的AGR2蛋白能够在体外促进γδT细胞的活化，增强γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性，有可能是γδT细胞识别的肿瘤相关蛋白配体。