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目的:通过长期孵育H2O2建立人白血病细胞K562耐药模型,考察反应氧族介导的肿瘤细胞产生多药耐药的机制。 方法:使用荧光倒置显微镜观察DCFH-DA染色后人白血病细胞K562和耐药细胞K562/A02的细胞内ROS(Reactive Oxygen Species)的分布和荧光强度,使用流式细胞仪检测DCFH-DA染色后人白血病细胞K562和耐药细胞K562/A02的细胞内的ROS含量。选用不同浓度的H2O2进行造模时间和浓度筛选,采用MTT法测定阿霉素(Adriamycin , ADM)对模型K562细胞的抑制率,根据筛选结果选取H2O2的造模时间和浓度,以此建立的耐药细胞模型命名为K562/ROS细胞。使用倒置显微镜观察K562/ROS细胞的形态学改变。采用MTT法测定各浓度紫杉醇(Taxol)、顺铂(Cisplatin,cDPP)、环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)、阿霉素和5-氟尿嘧啶(5-Flourouracil,5-FU)对K562/ROS细胞的抑制率,计算各抗肿瘤药物的IC50和模型细胞的耐药指数(Resistant Index,RI)。使用PI单染法对K562、K562/ROS、K562/A02细胞染色,流式细胞仪检测三组细胞的周期分布。使用 DCFH-DA 染色法对 K562、K562/ROS、K562/A02 细胞染色,流式细胞仪检测三组细胞内ROS的含量变化。使用Western blot法检测三组细胞P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的表达;流式细胞术检测K562、K562/ROS、K562/A02细胞对罗丹明 123(Rhodamine,Rh123)的累积能力、反应 P-gp 的活性;免疫染色后使用激光共聚焦显微镜观察K562、K562/ROS、K562/A02细胞中P-gp和掺入的BrDU的定位与含量;另对K562,K562/ROS、K562/A02细胞孵育PI3K和NF-κB的抑制剂LY294002、BAY11-7082,MTT法检测三组细胞对ADM 耐药性的变化;采用激光共聚焦显微镜检测K562、K562/ROS、K562/A02细胞中耐药、增殖相关的核转录因子NF-κB和的表达与定位;Western blot法检测细胞内p-Akt、p-IκB、p-STAT3、P-gp的表达,分析K562/ROS细胞耐药产生的机制。 结果:人白血病耐药细胞K562/A02内ROS的荧光强度高于敏感细胞K562,其含量约为敏感株细胞的2.46±0.34倍。经条件筛选,0.1 μmol/L的H2O2连续孵育12周建立的耐药细胞模型命名为 K562/ROS细胞。K562/ROS的细胞形态较敏感株发生较大的改变,由原来的圆形变为多毛刺、不规则状,细胞对瓶底的附着力增加,悬浮态减少,细胞呈团片状生长,细胞连接处模糊、增殖速度加快、代谢活性增加。K562/ROS 细胞具有多药耐药性,对紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶的耐药指数分别为292.82、3.35、4.41、52.65、1.73。与K562细胞相比,耐药细胞K562/ROS的G2/M期所占比例有显著增加。ROS含量检测结果表明:长期适量的H2O2孵育可升高K562细胞内的基础ROS的浓度水平。Western blot及激光共聚焦检测结果表明:长期调控ROS可诱导K562细胞表达P-gp,增加的P-gp主要分布在细胞膜上。Rh123的累积实验结果提示,K562/ROS 细胞上表达的 P-gp 具有较强的外排功能。通过机制研究发现:PI3K和NF-κB的抑制剂可不同程度的逆转K562/ROS细胞的耐药性,其结果与K562/A02细胞情况相似。使用PI3K的抑制剂LY294002可降低p-Akt的表达、抑制NF-κB的入核、减少p-STAT3、P-gp的含量。使用NF-κB的抑制剂BAY11-7082可抑制NF-κB的入核、降低 p-STAT3、P-gp 的表达,对 p-Akt 的含量无显著影响。同时使用 LY294002 和BAY11-7082均可显著下调K562/ROS细胞p-STAT3、P-gp的表达,与对K562/A02细胞作用相似。 结论:人白血病耐药株ROS的基础含量显著高于其敏感株。通过对K562细胞长期定量孵育ROS可促进细胞产生多药耐药,该耐药细胞命名为K562/ROS。K562/ROS细胞主要特征表现为:细胞内ROS含量增加、细胞形态变化、外排蛋白功能与表达增强、细胞周期改变、细胞增殖加速。耐药机制可能涉及过度激活的PI3K通路,通过诱导NF-κB核转录、激活STAT3通路,进而上调细胞上P-gp的功能与表达,最终介导肿瘤多药耐药产生。