论文部分内容阅读
复方五倍子抗菌剂是由课题组通过体外抑菌和药效学试验相结合，组方出的对水产动物细菌性疾病有良好防治效果的渔用中药复方。其中的主要单味药是五倍子。研究表明没食子酸为五倍子主要有效活性成分，具有抑菌、抗病毒，清除自由基和抗氧化作用。药物分析已证实复方五倍子抗菌剂含有没食子酸、鞣质、蒽醌、黄酮等。本论文优选五倍子提取方法，对五倍子及复方五倍子抗菌剂进行稳定性预测，研究了复方五倍子抗菌剂防治鱼体肝脏脂质过氧化特性，测定了复方五倍子抗菌剂对两种鱼生化指标影响结果，以及复方五倍子抗菌剂对鲫鱼细菌性败血症的防治作用。旨在优选五倍子提取工艺，确定五倍子和复方五倍子抗菌剂药物有效期，探讨复方五倍子抗菌剂抗氧化性能，证实复方五倍子抗菌剂对鱼体肝脏的保护、修复作用以及对细菌性败血症的防治和提高机体免疫机能的效果。1五倍子的超声提取工艺研究用正交设计法L9（34）以五倍子有效成分没食子酸的得率为指标，超声法考察乙醇浓度、溶剂倍量、提取时间和提取次数4个因素对提取率的影响，紫外分光光度计检测各组没食子酸含量，选出五倍子水剂最佳的提取条件。结果显示：在变幅杆为6φ，功率为400W，22kHZ，间歇超声3s-3s（每超声3s，间歇3s）的条件下，五倍子水剂最佳提取条件为80％乙醇15倍量超声提取3次，25min／次，此法得出没食子酸含量为19.4％。各个因素对没食子酸提取结果影响大小顺序为D（提取次数）＞B（溶剂倍量）＞A（乙醇浓度）＞C（提取时间）。其中D（提取次数）和B（溶剂倍量）对五倍子水剂中没食子酸提取含量影响显著（P＜0.05），而A（乙醇浓度）和C（提取时间）对五倍子水剂中没食子酸提取含量影响不显著（P＞0.05）。说明超声提取法能够在不破坏五倍子物质成分的情况下提高有效成分的得率，该技术可以避免某些干扰成分，对五倍子质量控制有良好效果。2经典恒温法对复方五倍子抗菌剂的热稳定性研究分别用超声法（80％乙醇15倍量超声提取3次，25min／次）和醇提法（60％乙醇20倍量76℃回流提取3次，2h／次）制备五倍子水剂和复方五倍子抗菌剂，以复方五倍子抗菌剂中有效成分没食子酸的得率为指标，经典恒温法结合留样观察法对以上两种制备方法进行热稳定性预测。结果显示：由Arrhenius回归方程Y=aX+b得出超声法制备的五倍子水剂和复方五倍子抗菌剂的有效期分别为69d、82d，醇提法制备的五倍子水剂和复方五倍子抗菌剂的有效期分别为63d、70d，与室温留样观察法得出的结果基本一致。表明采用超声法提取五倍子和复方五倍子抗菌剂能够提高有效成分得率，延长药物的有效期，且该复方的稳定性优于单方。3复方五倍子抗菌剂对鲫鱼肝匀浆脂质过氧化的作用研究超声提取复方五倍子抗菌剂粗粉，选择原提取液和正常血清对不同时间孵育的肝匀浆作用，测定其MDA抑制率；将提取液以不同给药方法灌喂鲫鱼，采集含药血清测定其MDA抑制率。结果显示：不同给药方法测定结果，孵育时间为1h的含药血清中，单次给药，二次给药，连续三天给药的最高抑制率分别为29.9％，39.69％和47.94％，出现抑制率峰值的先后顺序为单次给药，二次给药，连续三天给药。不同孵育时间测定结果，原提取液组MDA抑制率比较高，在延长孵育时间后作用效果仍维持在一定水平，测定的300min内都保持53％以上的抑制率，表明该复方清除自由基的能力较强，生药含量为0.125g／mL时，体外孵育240min其对MDA抑制率可以达到69.77％。正常的血清对体外肝匀浆脂质过氧化也有一定的抑制作用。4复方五倍子抗菌剂对两种鱼生化指标的影响以爱德华氏菌人工感染鱼体，用添加1.0％和3.0％两种不同浓度的复方五倍子抗菌剂药饵投喂鲫鱼和草鱼6d，于试验第7、13、20、27d进行鲫鱼肝脏和血液、草鱼肝脏谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、胆碱酯酶（CHE）、总胆红素（T-BIL）、碱性磷酸酶（ALP）五项指标的测定。结果显示：血液各指标测定结果，投喂27d后，鲫鱼血液谷丙转氨酶、碱性磷酸酶两用药组低于对照组（P＜0.05），总胆红素含量低于对照组，胆碱酯酶高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。肝脏各指标测定结果，试验第20d时，鲫鱼的谷丙转氨酶和谷草转氨酶两用药组高于对照组（P＜0.05），草鱼的谷丙转氨酶3.0％用药组、谷草转氨酶两用药组高于对照组（P＜0.05），试验第27d时，草鱼碱性磷酸酶两用药与对照组差异显著（P＜0.05），总胆红素、碱性磷酸酶两用药组在试验中均升高，但低于对照组，胆碱酯酶两用组组均降低，但高于对照组，各组间差异不显著（P＞0.05）。结果表明：预先给鱼体投喂复方五倍子抗菌剂药饵可以缓解疾病对机体带来的损伤，添加量控制在1.0％能达到良好的防治效果。5复方五倍子抗菌剂对鲫鱼免疫功能的影响研究1.0％复方五倍子抗菌剂药饵饲喂鲫鱼，温和气单胞菌对鱼体攻毒，攻毒前和攻毒后第5、12、19、26d检测外周血ANAE阳性比率、淋巴细胞吞噬活性、NBT阳性细胞、以及免疫器官脾脏，肾脏，肝脏的免疫器官指数研究中药对鲫鱼免疫功能的影响。结果显示：攻毒后，药饵预防组和治疗组死亡率分别为12.5％和20％，与对照组（37.5％）差异显著（P＜0.05）。免疫指标测定结果，复方五倍子抗菌剂药饵可以提高鱼体脾脏、肾脏、肝脏免疫器官指数，攻毒后第19d，阴性组中脾脏、肾脏，预防组中脾脏与对照组差异显著（P＜0.05）；攻毒后第26d，阴性组中脾脏、肾脏、肝脏，预防组中脾脏、肾脏，治疗组中肾脏与对照组差异显著（P＜0.05）。外周血ANAE阳性比率、淋巴细胞吞噬活性、NBT阳性细胞数量得到提高，攻毒后第19d鲫鱼阴性组与对照组的ANAE比率差异显著（P＜0.05）；攻毒后第26d，阴性组和预防组中ANAE阳性比率和淋巴细胞吞噬活性、预防组中NBT阳性细胞数量较对照组差异显著（P＜0.05），说明复方五倍子抗菌剂能够增强鱼体免疫能力，有效治疗细菌性败血症。