论文部分内容阅读
MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21nt的非编码小分子RNA,通过与靶基因3’-UTR区域结合从而对靶基因起抑制作用或对其直接降解。miRNA虽然数量很少,却参与了大量的生物学过程,例如细胞的生长与凋亡、癌细胞的增殖、组织与神经分化、细胞代谢、肌细胞和脂肪细胞的分化等。骨骼肌作为动物机体上最大的组织,其发育是一个十分复杂的过程,除了受到许多成生肌调节因子的调节外,表观遗传因素也对骨骼肌的发育起着重要遗传调控作用,如miRNA对mRNA的转录后修饰。经典Wnt/p-catenin信号通路广泛参与对许多生物学过程的调控,包括癌细胞的发育、纤维化、成骨分化等等。近年来,越来越多的研究发现Wnt/p-catenin信号通路还参与调控骨骼肌的发育过程,并且对不同肌纤维类型的分化形成也具有调控作用。而Wnt信号通路在行使其生物学功能的过程中,同样会受到许多miRNA的调控。本实验以C2C12细胞为模型,通过miRNA mimic和inhibitor分别实现miR143和miR145的高表达和抑制,重点研究miR143和miR145通过Wnt/p-catenin信号通路影响C2C12细胞分化的生物学机制。主要结果如下：1.在正常分化的C2C12细胞中,miR143和miR145表达量随着细胞分化过程的进行逐渐升高。2.在C2C12细胞分化第4天之后,高表达与低表达miR143和miR145都会使MyoD和MyoG的表达量极显著降低(P<0.01)。整个分化过程中miR143对Myf5的影响不显著(P>0.05),而过表达或低表达miR145都会使Myf5的表达水平极显著升高(P<0.01)。在细胞分化中期(第4天到第6天),MRF4会受到过表达miR143和miRl45的影响,而低表达miR143和miR145对MRF4的影响不显著(P>0.05)。过表达miR143和miR145会抑制成肌分化的标志基因MyHC和ACTA1的表达,而低表达miR145时会显著抑制MyHC的表达(P<0.01)。以上结果表明miR143和miR145参与对C2C12细胞分化过程的调控作用,但调控调控的作用存在差异。3.miR143能显著抑制4种肌纤维类型的表达,而且主要作用于Ⅱ型肌纤维。在细胞分化末期miR145不论高表达还是低表达都会显著抑制4种肌纤维的表达水平。以上结果表明miR143会抑制肌细胞分化过程的肌纤维类型分化,而过表达与低表达miR145主要抑制MyHCI和MyHC Ⅱa的表达水平。4.miR143和miR145对经典Wnt/β-catennin信号通路的调控主要在细胞分化中期(第2到第6天),过表达与低表达miR143和miR145都会极显著提高通路主要信号基因Axin2,LRP5和β-catenin的表达水平(P<0.01),但两个miRNA的调控作用有差异性。非经典Wnt信号通路的激活蛋白Wnt5a在过表达miR143和miR145时,其表达量都下降了,说明miR143和miR145不能通过非经典Wnt调控成肌分化。以上结果表明在C2C12细胞分化过程中,miR143和miR145对细胞分化早期调节因子有促进作用,但不能在细胞分化末期促进细胞分化后期调节因子的表达,而且会抑制成肌标志基因的表达。本研究还表明miR143和miR145会抑制肌纤维类型的分化,但能在细胞分化中期促进经典Wnt通路蛋白LRP5、Axin2、和β-catenin的表达。转染实验中miR143和miR145并未如期作用促进成肌分化,所以miR143和miR145对C2C12细胞分化的影响、miR143和miR145与Wnt信号通路之间相互作用的交互效应等还需要进一步深入的研究。