猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis viurs,EMCV)引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征的急性传染病。本研究针对EMCV非结构蛋白2C基因设计合成了一对特异性引物,通过RT-PCR获得了长为1062 bp的2C基因序列,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-2C,并在大肠杆菌BL21细胞中成功表达了62 ku预期大小的重组2C蛋白,蛋白表达量约为33.9%。重组2C蛋白于室温保存72 h,-20℃和-80℃分别保存12月,冻融9次未见降解。Western blot分析表明,重组2C蛋白可以被猪源或兔源抗EMCV阳性血清识别。以纯化的重组2C蛋白作为包被抗原建立了检测EMCV抗体的间接ELISA方法,确定了方法的最佳工作条件和阴阳性临界值,检测了方法的特异性、敏感性、重复性,并用该方法分析了EMCV感染动物2C抗体的产生动态。试验结果表明,间接ELISA的阴阳性临界值为0.27,以1μg/mL的重组2C蛋白于37℃包被1 h后4℃过夜,用含5%小牛血清的PBST于37℃封闭1 h,待检血清作1?20倍、酶标二抗作1?400倍稀释后分别于37℃反应1 h和45 min后,加底物后于室温避光显色15 min为最佳工作浓度和工作条件。重组2C抗原与猪抗CSFV、PCV2、PPV、PRV和PRRSV等5种阳性血清不发生交叉反应,EMCV可以阻断重组抗原与脑心肌炎阳性血清的特异性反应。该ELISA方法与血清中和试验的符合率为95.7%(22/23),相对敏感性为90.9%(10/11);同一时间批内重复性试验的变异系数<10%,不同时间批间重复性试验的变异系数<15%。应用该方法可以在EMCV感染仔猪后4 d,检测到相应抗体,感染后7 d抗体水平最高,随后逐渐下降,直至感染后21 d仍然可以检测到较低水平的2C抗体。应用建立的间接ELISA方法检测了2006~2008年间河北省不同地区31个规模化猪场的1306份血清样本。结果显示,EMCV抗体阳性率平均为13.48%,其中经产母猪的抗体阳性率最高(27.68%),其次为后备母猪和哺乳仔猪(分别为16.67%和2.86%),育成猪EMCV抗体阳性率最低(1.98%)。上述研究结果表明,重组EMCV 2C蛋白具有良好的稳定性和反应原性;以其作为包被抗原,建立的间接ELISA方法可以用于猪脑心肌炎的早期诊断和血清流行病学调查;河北省猪群中存在EMCV感染现象,尤以经产母猪的感染率最高。