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目的:应用全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY-5Y细胞分化;并探讨其向神经元分化过程中拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ,TopoⅡ),即TopoⅡα,β的表达情况;进一步研究转录因子特化蛋白1(Specificity protein1,Sp1)对TopoⅡβ基因表达调控的影响,以期深入了解神经干细胞向神经元分化的作用机制。方法:1细胞培养SH-SY-5Y细胞用含10%胎牛血清、1%B27、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培养液,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。2ATRA对SH-SY-5Y细胞作用浓度的筛选不同浓度的ATRA(1,5,10,25,50,100μmol/L)作用于人SH-SY-5Y细胞后,应用四甲基偶氮唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法测定细胞光密度值(Optical density,OD),计算生长抑制率和半数抑制浓度(IC50),做出生长曲线,从而筛选ATRA对SH-SY-5Y细胞的作用浓度。3SH-SY-5Y细胞分化百分率的检测不同浓度的ATRA(1,5,10,25,50μmol/L)作用于人SH-SY-5Y细胞后,用倒置显微镜观察各组细胞细胞数目、胞体直径和突起长度的变化,用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量各组细胞诱导前后的变化。神经干细胞分化标准为轴突延伸超过胞体直径二倍以上,观察时对每瓶细胞随机选取5个不同视野共计200个细胞,计算细胞分化百分率。4细胞形态学观察倒置相差显微镜观察细胞形态学改变,检测细胞分化情况。分为两组:①正常对照组,传代后正常培养细胞,并在培养基中加入与诱导分化组ATRA相同浓度的二甲基亚砜(Dimethyl-sulfoxide,DMSO),即10μmol/LDMSO。②诱导分化组,传代后换为条件培养基(含3%FBS、1%B27、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养液),并在培养基中加入10μmol/L ATRA。两组细胞在不同时间点(6h,24h,72h,120h)用倒置显微镜观察各组细胞细胞数目、胞体直径和突起长度的变化,用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量各组细胞诱导前后的变化。观察时对每瓶细胞随机选取5个不同视野共计200个细胞。5细胞周期观察①诱导分化组:传代后换条件培养液(含3%FBS、1%B27、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养液),并在培养基中加入10μmol/LATRA,培养72h后收细胞。②正常对照:传代后正常培养细胞,并在培养基中加入与诱导组ATRA相同浓度的DMSO,即10μmol/L DMSO,培养3d后收细胞。用流式细胞仪检测细胞周期的变化。6逆转录-聚合酶链反应(Revers transcription PCR,RT-PCR)RT-PCR半定量检测Sp1,Topo Ⅱ α,Topo Ⅱβ mRNA在ATRA诱导细胞分化过程中的变化,并用计算机图像分析系统进行半定量分析。7Western blot检测Western blot检测各组细胞神经元分化标记物,微管相关蛋白2(Microtubule-associated protein2, MAP2),Sp1,TopoⅡ α,TopoⅡ β蛋白在SH-SY-5Y细胞向神经元分化过程中的表达变化,并用凝胶图像分析系统测定并计算各蛋白条带的积分光密度同对应β-actin积分光密度比值。8染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测转录因子Sp1是否特异性结合于TopoⅡ β基因启动子GC盒,并对提取纯化的DNA应用RT-PCR进行定量分析。结果:1SH-SY-5Y细胞呈贴壁、簇状生长;胞体小而圆,少数呈梭形,大多数为不规则的多边形,伸出多个较短的神经突起。2MTT结果显示,不同浓度的ATRA(1、5、10、25、50、100μmol/L)作用于SH-SY-5Y细胞24h、48h、72h、96h、120h后可以抑制细胞的增殖,在lμmol/L~25μmol/L浓度范围内随ATRA浓度的增加,抑制作用逐渐加强,且随着ATRA作用时间的延长,抑制作用也逐渐加强,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。ATRA浓度为50μmol/L和100μmol/L诱导细胞分化时,总细胞数明显减少。实验结果说明,ATRA对SH-SY-5Y细胞的抑制作用在lμmol/L~25μmol/L内呈时间-剂量依赖关系。根据不同药物浓度下的OD值,绘制了细胞生长曲线。应用半数抑制浓度(IC50)计算软件计算药物ATRA对SH-SY-5Y细胞的IC50:第24h为34.259±2.183μmol/L;第48h为19.621±1.540μmol/L;第72h为10.330±0.942μmol/L;第96h为7.876±0.625μmol/L;第120h为5.706±0.490μmol/L。3细胞分化百分率检测结果显示,ATRA诱导SH-SY-5Y细胞向神经元分化过程中,5、10、25μmol/L ATRA在诱导分化第6~72h细胞分化百分率逐渐增加,其中,10μmol/L ATRA在诱导分化的第72h,细胞分化百分率达到最高(78.540±2.037%),即诱导分化为神经元的细胞数目最多。因此,本文选用10μmol/L ATRA作用浓度,诱导细胞向神经元分化,并继续进行下列实验研究。4细胞分化形态学观察与对照相比,诱导分化第6h,ATRA诱导分化组细胞数目和神经突起长度无明显变化;诱导分化第72h,细胞数目减少,胞体聚集生长,具有多个细长神经突起,且长度明显增长,交织成网,具备成熟神经元形态,诱导组各时间点与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。5流式细胞仪检测细胞周期显示, SH-SY-5Y细胞经10μmol/LATRA诱导分化72h后,与正常对照组相比,G0/G1期细胞增加25.2%,G2/M期细胞降低24.7%,细胞增殖指数PI降低25.2%,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞周期的变化说明,大多数细胞处于G0/G1期,细胞增殖受到明显抑制。6RT-PCR结果显示,TopoⅡ α mRNA的表达在ATRA诱导分化的第6~72h逐渐减少;而Sp1与TopoⅡ βmRNA的表达在ATRA诱导分化的第6~72h逐渐增加。培养基中加入Sp1的特异性抑制剂光辉霉素(Mithram-ycinA)作用后,Sp1、TopoⅡα和TopoⅡβ mRNA均出现表达下调。7Western blot结果显示,在向神经元诱导分化过程中,神经元特异标记蛋白MAP2的表达逐渐增加,分化至72h表达量最高。TopoⅡα蛋白的表达在ATRA诱导分化的第6~72h逐渐减少;而Sp1与TopoⅡβ蛋白的表达在ATRA诱导分化的第6~72h逐渐增加。培养基中加入Mithramyci-nA作用后,Sp1、TopoⅡα和TopoⅡβ蛋白质均出现表达下调。8染色质免疫沉淀结果显示,ATRA诱导SH-SY-5Y细胞向神经元分化过程中,随着诱导分化时间的进行,特异性结合在TopoⅡβ基因启动子GC盒的Sp1蛋白表达逐渐增高。同时,培养基中加入Sp1特异性抑制剂MithramycinA作用后,特异性结合在TopoⅡβ基因启动子GC盒的Sp1蛋白表达逐渐降低。结果显示,SH-SY-5Y细胞向神经元分化过程中,Sp1可促进TopoⅡβ基因表达。结论:1应用ATRA可诱导SH-SY-5Y细胞向神经元分化,结果显示5、10、25μmol/L ATRA在诱导分化第6~72h细胞分化百分率逐渐增加,其中,10μmol/L ATRA在诱导分化的第72h,细胞分化百分率达到最高。2SH-SY-5Y细胞向神经元分化过程中,细胞周期的变化说明大多数细胞被阻滞于G0/G1期,G2/M期细胞显著降低,细胞增殖受到明显抑制,TopoⅡα mRNA及其蛋白的表达逐渐减低与细胞的增殖受到抑制有关。TopoⅡα的表达水平与细胞的分化程度呈反比。3SH-SY-5Y细胞向神经元分化过程中,Sp1,TopoⅡβ的mRNA及其蛋白的表达逐渐增加与神经干细胞的分化密切相关,TopoⅡ β的表达水平与细胞的分化程度呈正比,即表达高者神经元分化程度高。4转录因子Sp1通过特异性的结合TopoⅡ β基因启动子的GC盒,上调TopoⅡ β基因的表达,参与神经干细胞的诱导分化。