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本文以虫草属Cordyceps(Fr.)Link 8种虫草为研究对象,应用DALP(Directamplification oflength polymorphism)分子标记技术,分析其遗传结构及遗传多样性,并观察了4种新鲜虫草的显微结构。结合形态特征,从形态、组织、分子3个层面探讨了这些虫草之间的遗传关系。试图尽可能地揭示虫草天然的显微结构以及它们之间的亲缘关系,为更加客观地建立虫草分类系统提供基础参考资料。研究结果概括如下:
1形态特征:凉山虫草Cordyceps liangshanensis M.Zang,D.Q.Liu & R.Y.Fu菌核粗壮饱满,长度、直径、重量在这8种虫草中都较大,且子座最长,最显著,但直径较小。古尼虫草Cordyceps gunnii(Berk.)Berk.、冬虫夏草Cordycep ssinensis(Berk.)Sacc.、阔孢虫草Cordypcepsc crassispora M.Zang & D.R Yang例都比较匀称,其中古尼虫草相对个头较大,而冬虫夏草和阔孢虫草以及阿尔泰虫草较相似,尤其是前两者,单从形态特征方面不易区分开。拟黑虫草Cotdymceps nigrolla Y.K.etD.Shimizu和蝉花虫草Codyrceps cicadae(Hill)Berk.et Br.的寄主相似(或许相同),二者菌核最为粗大,但子座有所区分,拟黑虫草子座少有分枝,在这8种虫草中子座直径最大;蝉花虫草子座均丛生,多分枝,未见单枝者,且每一小枝子座直径较小。从兰坪采得的一种虫草其菌核,子座的直径,重量都最小,子座长为2.4~4.6cm,直径为1~2mm。
2组织结构特征:蝉花虫草未发现子囊壳及子囊孢子。古尼虫草、拟黑虫草和北虫草在子囊壳、子囊壳壁、子囊、子囊孢子、子囊孢子横隔隔距的大小方面以及子囊帽的形状方面存在着较大的差异。3种虫草子囊壳的大小依次为:古尼虫草 (550.41~1O13.82)×(190.80~278.50)μm>拟黑虫草(282.30~450.50)×(131040~235.10)μm>人工北虫草Cordyceps militaris(Fr.)Link(200.70~352.10)×(129.50~184.50)μm。子囊的长宽也基本遵循这样的先后顺序。对于子囊壳壁厚度,拟黑虫草子囊壳壁最厚(平均24.53gm),其次是人工北虫草(平均18.481μm),最后是古尼虫草(平均9.131μm)。古尼虫草子囊孢子直径为2.15~3.70μm,平均大小为2.91μm;拟黑虫草子囊孢子直径为3.05~4.31μm,平均大小为3.72μm;人工北虫草子囊孢子直径为0.95~2.05μm,平均大小为1.52μm。另外,古尼虫草子囊孢子横隔隔距为3.72~4.72μm,平均大小为4.19μm;拟黑虫草为5.90~8.12μm,平均为7.13μm:人工北虫草为1.64~3.98μm,平均为3.00μm。
3遗传特征:DALP研究显示,在8种虫草12个居群菌核中,5个DALP引物共扩增192条重复性高的清晰条带,平均每个引物扩增条带数为38.4。其中古尼虫草3个居群总的多态位点百分比PPB为85.42%;冬虫夏草2个居群总的PPB为52.60%;阿尔泰虫草2个居群总的PPB为77.60%;阔孢虫草1个居群PPB为42.19%:拟黑虫草1个居群PPB为47.40%;蝉花虫草1个居群PPB为44.79%;凉山虫草1个居群PPB为46.35%;虫草一种1个居群PPB为53.12%。古尼虫草3个居群菌核总的基因多样性指数Ht为0.3004,居群内多样性指数Hs为0.2098,居群间基因分化系数Gst为0.3014,即古尼虫草菌核约有30.14%的遗传变异来自居群之间,69.86%来自居群内。冬虫夏草2个居群菌核总的基因多样性指数胁为0.1803,居群内多样性指数胁为0.1092,居群间基因分化系数Gst为0.3943,即冬虫夏草菌核约有39.43%的遗传变异来自居群之间,60.57%来自居群内。阿尔泰虫草2个居群菌核总的基因多样性指数Ht为0.2965,居群内多样性指数Hs为0.2298,居群间基因分化系数Gst为0.2249,即阿尔泰虫草菌核约有22.49%的遗传变异来自居群之间,77.51%来自居群内。这3种虫草菌核在居群间遗传分化都达20%以上,分化较为显著。
关于子座的遗传结构及遗传分化分析也显示出相似的结果。在6种虫草lO个居群子座中,古尼虫草3个居群总的多态位点百分比PPB为82.29%;冬虫夏草2个居群总的PPB为60.94%;阿尔泰虫草2个居群总的PPB为82.29%;阔孢虫草1个居群PPB为64.06%;拟黑虫草1个居群PPB为48.44%;蝉花虫草1个居群PPB为54.69%。古尼虫草3个居群子座总的基因多样性指数Ht为0.2832,居群内多样性指数Hs为0.1858,居群间基因分化系数Gst为0.3440,即古尼虫草子座约有34.40%的遗传变异来自居群之间,65.60%来自居群内。冬虫夏草2个居群子座总的基因多样性指数Ht为0.2007,居群内多样性指数Hs为0.1400,居群间基因分化系数Gst为0.3024,即冬虫夏草子座约有30.24%的遗传变异来自居群之间,69.76%来自居群内。阿尔泰虫草子座2个居群总的基因多样性指数Ht为0.3145,居群内多样性指数Hs为0.2616,居群间基因分化系数Gst为0.1683,即阿尔泰虫草子座约有16.83%的遗传变异来自居群之间,83.17%来自居群内。这3种虫草子座在居群间的遗传分化都高于15%,分化较为显著。
UPGMA聚类显示,无论是通过菌核还是子座来进行聚类,各个物种及其居群在系统树中的相对位置都基本吻合。说明,同一虫草个体的菌核和子座在遗传本质上基本上是一致的,在取样提取DNA时选择菌核或子座对聚类分析没有太大的影响。
在两次聚类中,冬虫夏草、阔孢虫草以及阿尔泰虫草都能够很好的聚在一起,而且显示出较高的遗传一致度。我们认为,可把这3种虫草归属于一个类群。形态观测数据也证实了这一点。长期的地理隔离促进了不同种虫草的形成。