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肝癌、肝炎等肝脏疾病是严重威胁人类健康的常见病和多发病,常规剂型的药物经静脉注射、口服或局部注射后,药物非特异性分布于全身,毒副作用较大。靶向给药系统通过载体可将药物选择性递送至肝脏的病变部位,可降低对正常组织和全身的毒副作用,减少给药剂量和给药次数,提高药物功效。其中两亲性聚合物纳米粒作为给药载体,可提高难溶性药物的溶解性和稳定性、延长血液循环时间、改善药物体内分布,并具有良好的缓控释效果。聚合物纳米粒表面经特异性配体(GL)修饰,可实现药物对肝癌细胞的主动靶向。据此,设计并研究新型肝靶向性聚合物纳米粒-甘草酸(GL)修饰羧甲基壳聚糖纳米粒(CMCNP-GL),以紫杉醇(PTX)为抗肿瘤模型药物制备载药纳米粒,研究PTX/CMCNP-GL的理化性质、载药与释药、体外细胞摄取与体内组织分布、体外细胞增殖抑制与体内抑瘤率,考察不同GL取代度对PTX/CMCNP-GL体内外肝癌细胞靶向性及抗肿瘤效果的影响,并通过体内外试验初步评价CMCNP-GL载体的安全性。1CMCNP-GL的制备与表征以O-羧甲基壳聚糖(O-CMC)为亲水主链,甲基丙烯酸甲酯(MMA)为疏水单体,在APS引发剂作用下,通过自由基聚合法制得具有核壳结构的羧甲基壳聚糖纳米粒(CMCNP)。高碘酸钠氧化甘草酸制备GL醛,经氨醛缩合与硼氢化钠还原反应将GL醛接枝至CMCNP表面游离氨基,制得CMCNP-GL。改变投料比合成不同GL取代度的CMCNP-GL1、MCNP-GL2和CMCNP-GL4、 FTIR、1HNMR、DSC表征CMCNP-GL的结构,TEM观察纳米粒形态,分别测定GL取代度、接触角、粒径和Zeta电势,并研究CMCNP-GL在不同条件下的稳定性。结果表明CMCNP-GL1、CMCNP-GL2和CMCNP-GL4中的GL取代度分别为2.4%、6.9%和9.6%;CMCNP-GL为大小均一的球形粒子,平均水合动力学粒径为100～250nm,生理条件下荷恒定负电(--30mV)。随GL取代度的增大,粒径先增加后减小,Zeta电势无明显改变,纳米粒表面亲水性逐渐增强。CMCNP-GL具有良好的冻干和贮存稳定性,不同的pH、离子强度及生理条件下理化性质均保持稳定。2载紫杉醇CMCNP-GL的制备、表征及体外释药特性以PTX为模型药物,研究CMCNP-GL作为难溶性抗肿瘤药物载体的特点。超声法制备不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL,测定其平均水合动力学粒径为110～205nm,生理条件下Zeta电势约为-30mV,与相对应的空白纳米粒粒径与Zeta电势基本相同。不同GL取代度的CMCNP-GL载药量与包封率均随GL取代度的增加而增大,对PTX的包封率均高于69.0%,最高可达81.5%；载药量均高于13.0%,最高可达15.1%。PTX/CMCNP-GL的体外释放表现为先突释后缓释的释放行为,PTX释放速率随GL取代度的增加而减慢,均显著低于PTX/CMCNP,表明GL表面修饰可增强CMCNP对PTX的缓释能力。不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL在各时间点的累积释放百分率无显著性差异。3载紫杉醇CMCNP-GL的体内外靶向性制备罗丹明B (RhB)荧光标记纳米粒RhB-CMCNP和不同GL取代度的RhB-CMCNP-GL,以肝癌细胞SMMC-7721与正常肝细胞L02为细胞模型,研究纳米粒的细胞黏附、细胞摄取、摄取机制与亚细胞定位。CMCNP-GL在二种细胞的黏附率和摄取率均显著高于CMCNP,不同GL取代度的CMCNP-GL在肝癌细胞的黏附率和摄取率均显著高于正常肝细胞,不同GL取代度的CMCNP-GL之间无显著性差异。游离GL分子可与肝细胞表面GL特异性结合位点相互作用,竞争性抑制CMCNP-GL的摄取,对CMCNP的摄取无影响,该抑制作用在肝癌细胞中比正常细胞显著。CMCNP-GL2主要经小窝蛋白及网格蛋白介导的内吞途径入胞,摄取过程具有能量依赖性,且与细胞的骨架重构有关。GL修饰对CMCNP的内吞途径无显著影响,入胞后主要聚集在细胞核周围的胞质中。以H-22肝癌荷瘤小鼠为模型,分别考察空白纳米粒与载药纳米粒经静脉注射后的体内分布,评价纳米粒的靶向性。结果表明PTX/CMCNP-GL2可显著减缓PTX在血液中的清除速率,改善PTX的体内分布,聚集于肝脏和肿瘤,显著降低PTX的心脏和肾脏毒性；PTX/CMCNP-GL2对肝癌组织的靶向性显著高于未修饰的PTX/CMCNP和PTX注射液。空白载体与载药纳米粒的体内分布趋势一致。4载紫杉醇CMCNP-GL的体内外抗肿瘤功效及安全性以SMMC-7721细胞为肝癌细胞模型研究PTX/CMCNP抑制肿瘤细胞增殖或诱导细胞凋亡的能力；以H-22肝癌荷瘤小鼠为模型,考察载药纳米粒的体内抗肿瘤功效,比较不同GL取代度对载药CMCNP体内外作用功效的影响。结果表明PTX/CMCNP-GL可显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的体外增殖,72h的IC50为2.7～3.2mg·ML-1,显著低于PTX注射液(13.5mg·mL-1)和PTX/CMCNP (8.1mg-mL-1).不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL之间无显著性差异。PTX可诱导一定程度的肝癌细胞凋亡,24h的凋亡率均为1020%,CMCNP纳米载体及其GL表面修饰对PTX引起细胞凋亡的机制和效果无显著影响。静脉注射PTX/CMCNP-GL可有效抑制H-22荷瘤小鼠的肿瘤生长,延长肿瘤倍增时间。PTX/CMCNP-GL的抑瘤效果最佳,平均抑瘤率为87.4%,分别约为PTX注射液和PTX/CMCNP的2.5和1.6倍,表明PTX经CMCNP包载后,抗肿瘤效果显著增强,不同GL取代度PTX/CMCNP-GL的抗肿瘤效果无显著差异。考察CMCNP-GL空白载体的细胞毒性、血液相容性、急性毒性和亚急性毒性,从细胞、组织和动物整体水平初步评价CMCNP-GL的安全性。FDA/PI双染色、LDH、中性红、蛋白质含量测定试验结果表明正常肝细胞L02和肝癌细胞SMMC-7721与不同GL取代度CMCNP-GL (5mg·mL-1)短时间(6h或24h)作用后,胞外LDH释放量、胞内中性红摄入量、蛋白质含量均无显著变化,细胞活力无显著影响；MTT试验结果表明二种细胞与CMCNP-GL (5mg·mL-1)较长时程(72h)共培养后,细胞增殖率无显著影响,CMCNP-GL细胞毒性低。CMCNP-GL溶血率低于5%,血浆复钙时间较长,动态凝血率低于硅化玻璃,具有一定的抗凝血效果,血液相容性良好。CMCNP-GL小鼠尾静脉给药最大耐受剂量为1800mg·kg-1;亚急性毒性试验中连续15天静脉注射给予CMCNP-GL2(1800mgkg-1),小鼠体重增长正常,血液学指标和肝功能指标ALT/AST/ALP正常,主要器官重量正常,组织切片中未见炎症、坏死、水肿等病理现象,表明CMCNP-GL2静脉注射安全性好,不引起肝损伤和全身毒性。