论文部分内容阅读
非生物胁迫制约着农作物的生长发育及产量。microRNA在植物抗非生物胁迫中具有一定作用。本实验室构建了共胁迫（干旱、盐和碱）下玉米郑58幼苗microRNA文库，其中zma-miR169c在文库中下调7倍多，表明zma-miR169c可能与玉米响应非生物胁迫相关。因此，本研究以玉米郑58为材料，研究玉米zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13在植物响应非生物胁迫中的作用。 qPCR结果表明，玉米幼苗在受到干旱、ABA、缺钾、NaCl、Na2CO3及低温胁迫时地上部分和地下部分的zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13都呈不同程度的上调或下调表达。由此，可推测zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13可能与植物抗非生物胁迫相关。zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13在玉米的根、茎、叶、雄穗、花丝和种子中都有表达，且在雄穗、花丝和种子中表达量较高。由此，可推测zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13可能与玉米的生殖发育有关。 通过PCR扩增的方法克隆得到319 bp的基因序列，其中包含134 bp的zma-miR169c前体序列，102 bp上游旁侧序列及83 bp下游旁侧序列。Blastn比对结果表明zma-miR169c前体序列与miRBase中B73玉米的pre-miR169c的序列同源性为100%。构建了玉米表达载体ubi:zma-pre-miR169c，并采用冻融法将其转入农杆菌EHA101中。 通过部分编码区的扩增、3’RACE和5’端PCR的方法克隆出长为1147 bp的ZmNF-YA13基因，其中ORF822 bp，5’UTR47 bp，3’UTR278 bp，共编码273个氨基酸，其中3’UTR上含有zma-miR169c的切割位点。氨基酸序列分析表明，其含有 NF-YB/C结合区、DNA结合区及中间连接区这三个保守结构域。ZmNF-YA13氨基酸序列与其它植物来源的NF-YA3同源性为39%-72%。系统发育分析结果表明，ZmNF-YA13与小麦的TaNF-YA10的亲缘关系最近。上述结果表明该基因为NF-YA家族成员。构建了玉米表达载体ubi:ZmNF-YA13（ORF）、ubi:ZmNF-YA13（ORF+3’UTR）和烟草表达载体35s:ZmNF-YA13（ORF），并采用冻融法将其转入农杆菌EHA101中。 通过农杆菌介导的叶盘转化法将35s:ZmNF-YA13（ORF）转入烟草中，共获得6个转化株系。通过基因组PCR、RT-PCR及半定量RT-PCR检测转基因植株ZmNF-YA13基因的转入及表达情况，选择表达量较高的L3和L4株系用于后续干旱生理实验。干旱胁迫1 w后转基因烟草L3和L4株系的叶片相对含水量、干重、鲜重及超氧化物歧化酶活性均高于野生型，转基因株系根系较为发达。上述结果表明，ZmNF-YA13基因能够提高转基因烟草对干旱的耐受性。