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B7-H1(B7 homolog 1),也称PD-L1(programmed death receptor ligand 1)或CD274,是近年来发现的新共刺激分子,它是B7家族的一员。目前研究显示,B7-H1的受体为PD-1和一个未明确的受体。B7-H1与T细胞上的受体结合可以调节T细胞的增殖和分化。B7-H1 mRNA表达在人体多种组织中,而其蛋白在正常组织中的表达仅限于巨噬细胞系统。B7-H1也表达在多种肿瘤细胞株和多种肿瘤组织中,某些细胞因子和炎症因子可以上调肿瘤细胞表面B7-H1的表达。肿瘤细胞可能通过B7-H1/PD-1共刺激信号途径逃避宿主对肿瘤的特异性T细胞免疫应答。干预共刺激信号可以成为增强或终止免疫应答的一种手段,因而日益受到关注。目前认为,肿瘤细胞的免疫逃避是食管癌发生发展的重要机制之一。但是,B7-H1在食管癌的表达及其对食管癌特异性T细胞免疫应答的影响所知甚少。本研究检测了B7-H1在食管癌细胞株和食管癌组织中的表达,分析了其与食管癌患者临床病理学指标的相关性,并初步探讨了B7-H1对食管癌组织浸润T淋巴细胞功能的影响。方法1.细胞培养食管癌细胞株EC9706常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中。2.B7-H1在食管癌细胞株EC9706中表达的检测应用RT-PCR、免疫组化和流式细胞技术在mRNA水平和蛋白水平检测了B7-H1基因在食管癌细胞株EC9706中的表达情况。3.B7-H1在食管组织中表达的检测应用RT-PCR、免疫组化和Western blot技术在mRNA水平和蛋白水平分别检测了B7-H1基因在54例食管癌组织和8例癌旁正常食管组织中的表达情况,并分析了B7-H1的表达与食管癌患者临床病理学指标的相关性。用Syngene凝胶分析软件和TotolLab 2.0分析软件分别对54例食管癌组织中B7-H1 mRNA和蛋白的表达进行了半定量分析,并进一步分析了B7-H1 mRNA和B7-H1蛋白在食管癌中表达的相关性。4.T淋巴细胞体外共培养实验采用Percoll不连续密度梯度沉淀法从食管癌组织中分离T淋巴细胞,并转移到用可溶性B7-H1-Ig和抗CD3抗体包被的24孔培养板中,培养一段时间后,检测T淋巴细胞分泌细胞因子的变化,同时设立只包被抗CD3抗体的实验对照。5.ELISA检测细胞培养上清中的细胞因子T淋巴细胞体外与抗CD3抗体和B7-H1-Ig共培养48h后,分别收集不同培养体系中的上清,采用ELISA试剂盒检测其中IL-10和IFN-γ的含量。6.统计学处理应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理,计数资料计算阳性率,阳性率的比较采用x~2检验。计量资料,统计学数据用均数±标准差((?)±s)表示,两样本均数的比较用t检验,相关性分析采用Spearman等级相关检验。以α=0.05为检验水准。结果1.B7-H1在食管癌细胞株EC9706中的表达RT-PCR、免疫组化和流式细胞仪检测结果显示,食管癌细胞株EC9706在mRNA和蛋白水平均表达B7-H1,阳性表达率为28.88±3.22%,并且B7-H1蛋白定位于细胞膜和少量胞质中。2.B7-H1在食管癌组织中的异常表达RT-PCR、免疫组化和Western blot检测结果显示,食管癌组织在mRNA和蛋白水平均表达B7-H1,但食管癌组织中癌细胞阳性表达分布不均,团片状分布,有的癌巢表达,有的癌巢不表达,阳性表达率为48.15%,而所有的癌旁正常食管组织中均检测不到B7-H1 mRNA和蛋白的表达。通过对食管癌组织中B7-H1 mRNA和蛋白的表达进行半定量分析,发现B7-H1mRNA和蛋白在食管癌组织中的表达具有高度相关性(r=0.801,P＜0.05)。3.食管癌中B7-H1的表达与临床病理学特征的关系通过分析B7-H1的表达与食管癌患者临床病理学指标的相关性,发现B7-H1在食管癌组织中的表达与患者的年龄、性别、肿瘤的部位、食管癌的分化程度及肿瘤的大小无显著相关性(P＞0.05),与食管癌浸润深度、周围淋巴结转移、远处转移及p TNM分期有显著相关性(P＜0.05)。4.ELISA检测细胞因子的结果ELISA检测结果显示,包被B7-H1-Ig和抗CD3抗体的实验组比起只包被抗CD3抗体的对照组,T淋巴细胞分泌IL-10升高,而分泌IFN-γ降低,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论1.食管癌细胞可能通过异常高表达B7-H1而参与免疫逃避,从而促进食管癌的发生。2.B7-H1与食管癌患者预后不良的病理学指标显著相关,表明B7-H1有可能作为临床上预测食管癌转移潜能与判断食管癌患者预后的一个新指标,也可能成为食管癌免疫治疗的新靶点。3.B7-H1可能通过上调具有免疫抑制作用的IL-10含量,同时下调具有免疫杀伤功能的IFN-γ含量来抑制食管癌组织浸润T细胞的功能。