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背景: 原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)以下简称肝癌,是严重影响人类生存率的常见恶性肿瘤之一,发病率占恶性肿瘤的第五位,病死率占癌肿死因的第三位,每年新发病例大约60万人,大约55%来自于中国,已经成为严重威胁我国人民生命健康的恶性肿瘤之一。肝癌术后5年复发率高达70%,其中80%的复发病灶发生在肝脏(肝内转移)成为肝癌病人术后死亡的主要原因。在临床工作中我们发现,一部分肝癌病人病程早期即出现肝内转移或(和)远隔转移、或术后短时间内出现复发,而有些病程晚期病人却没有出现转移或切除后复发。因此,肝癌是否发生转移和复发有其内在的始动、促发因素,对此我们还不甚了解。深入研究肝癌转移和复发规律及机制,寻找新的分子治疗靶点,对提高疗效、改善预后具有重要意义。 ATAD2(ATPase familyAAA domain-containing protein2)基因,定位于人染色体8q24.13,在一些肿瘤中参与调控染色质动力活性、基因组转录活性和细胞凋亡过程。其编码蛋白质具有两个结构域:AAA区域和溴区结构域(Bromodomain)。AAA区域做为分子伴侣,执行装配、操作、分解蛋白复合物的功能;溴区结构域参与基因转录调控、细胞周期调控、信号转导,其表达异常导致恶性肿瘤发生和发展。深入研究其作用机理将为肿瘤治疗提供新的策略,有望成为新的肿瘤表面标志物和治疗靶点。 Hedgehog(Hh)信号通路是高度保守的信号传导通路,近几年发现,肝癌中存在异常Hh信号,其在肝癌的侵袭转移中起着重要作用。参与Hh信号转导的主要成分有:Hh蛋白、Ptch1蛋白、Smo蛋白和Gli蛋白。膜受体蛋白Ptch1与分泌因子Hh结合后,促进其共受体膜蛋白Smo构相改变,触发细胞内一系列包括Gli-1在内的下游因子的激活。Ptch1是Hh信号通路的的关键基因,其表达强度在一定程度上可以代表Hh信号的活性程度,Gli是Hh信号通路中重要的转录因子,其过度表达可诱导Snail的活性,抑制E-钙粘附素(E-cadherin,E-cad)表达及上调基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达,促进肿瘤侵袭转移。我们利用RNAi技术将高转移肝癌细胞株HCCLM3细胞中的ATAD2基因沉默,PCR Array基因芯片筛查结果显示, Hedgehog信号转导通路关键活性因子Ptch1基因表达显著抑制。因此,我们推测ATAD2基因可能调控Ptch1表达,激活Hedgehog信号转导通路,进而影响肝癌细胞的侵袭转移等生物学行为,但其具体作用机制尚不清楚,有待我们进一步研究。 方法: 一、实验对象 1.IHC检测80例原发性肝细胞癌组织中ATAD2,Ptch1,SMO,Gli2的蛋白表达情况。 2.收集25例手术切除的新鲜肝癌组织标本包括癌组织和癌旁组织,应用RT-PCR检测RIN1在mRNA的表达情况,并进行分析对比。 3.肝癌细胞诛HCCLM3 二、实验方法 1、细胞培养:人肝癌细胞株培养HCCLM3。 2、RealTimePCR检测ATAD2,Ptch1,SMO,Gli2基因mRNA水平在组织中的表达和传染前后细胞中的表达。 3、免疫组织化学检测肝癌组织中ATAD2,Ptch1,SMO,Gli2蛋白表达水平。 4.Westernblot检测转染前后,HCCLM3细胞株中的ATAD2,Ptch1,SMO的蛋白水平表达 5、应用Transwell实验检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞侵袭迁移能力变化。 6、应用细胞周期试剂盒检测ATAD2沉默表达后肝癌细胞细胞周期变化。 结果: 第一部分 ATAD2基因在肝细胞肝癌中的表达及临床意义 1、PCR结果显示25例肝癌标本中ATAD2,Ptch1,SMO,Gli2在肝癌组织中表达高于其对应的癌旁组织。 2 IHC结果显示ATAD2,Ptch1,SMO,Gli2在肝癌组织中呈高表达(54/80,67.5%),(44/80,,55%),(42/80,52.5%),(58/80,72.5%)。 3.肝癌组织ATAD2表达变化与临床病理因素结果显示,ATAD2、Ptch1、Gli2表达与增殖转移(P<0.05)密切相关;多因素分析显示ATAD2,Ptch1,Gli2高表达能够独立预示肝癌病人术后生存率低,预后差。 第二部分 ATAD2基因沉默后对肝癌细胞生物学特性的影响 1、沉默表达ATAD2基因,RealTimePCR结果显示,与对照组相比,HCCLM3细胞中ATAD2,Ptch1,SMO,Gli2的mRNA的表达均被抑制。 2.WesternBlot结果与PCR结果趋势一致。 3.Transwell实验结果显示,HCCLM3细胞侵袭及迁移能力下。 4.细胞周期实验结果显示沉默表达ATAD2基因,细胞周期出现停止,阻滞于G1/S期。凋亡实验结果显示沉默ATAD2基因后,HCCLM3细胞凋亡率显著升高。 结论: 1.ATAD2,Ptch1,SMO,Gli2在原发性肝细胞癌组织中呈高表达,是肝癌患者预后不良的因素。 2.沉默ATAD2后,与对照组比较,肝癌细胞株HCCLM3的侵袭转移能力均下降,肝癌细胞周期阻滞于G1/S期,细胞凋亡率增高。 3.沉默ATAD2后,Hh通路的关键基因表达均被抑制。