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犬布氏杆菌病是由犬布氏杆菌引起的人畜共患传染病。目前常用的诊断方法有血清学方法,PCR诊断方法及细菌培养方法。传统的检测方法如试管凝集试验、平板凝集试验、琼脂免疫扩散试验、细菌分离培养及PCR检测都有一定的缺陷。ELISA方法是目前公认一种快速、敏感、特异的检测方法。该方法操作简便,耗时少,便于向临床推广。为此,本研究运用原核表达技术表达了犬布氏杆菌以铜/锌为辅基的超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD),并以该重组蛋白为抗原,建立了犬布氏杆菌间接ELISA(iELISA)快速检测方法。
本实验根据Genbank公布的犬布氏杆菌Cu/Zn-SOD基因设计一对特异性PCR引物,以标准的犬布氏杆菌基因组为模板,用PCR方法扩增出长度为462bp的特异性片段,将其克隆到pMD-18T载体上并测序,将测序正确的目的基因连接到表达载体pET-28a(+)中,构建了pET-SOD重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定并经亲和层析纯化得到该蛋白。将纯化的蛋白与弗氏佐剂混合,免疫新西兰兔,制备兔抗犬布氏菌Cu/Zn-SOD多克隆抗体。以纯化的重组Cu/Zn-SOD蛋白为包被抗原,对抗原浓度、血清浓度、二抗浓度、抗原与血清作用时间、血清与二抗作用时间、底物作用时间分别进行优化,建立了犬布氏杆菌的iELISA检测方法,对其进行敏感性、特异性和稳定性的试验。并对60份有流产不育等症状的犬血清样品进行了检测,同时运用虎红平板凝集试验对临床样品进行检测,比较了两者的符合率。
结果表明:重组Cu/Zn-SOD蛋白大小在20KD左右,IPTG最佳诱导浓度为0.4mmol/L,最佳诱导时间为4h。Western-Blot分析表明,重组蛋白与犬布氏杆菌阳性血清有特异性反应,具有良好的免疫原性。制各的兔抗犬布氏菌Cu/Zn-SOD多克隆抗体血清抗体效价高。iELISA反应最佳抗原浓度为2μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:200,二抗最佳稀释倍数为1:4000,抗原和血清、二抗作用最佳时间都为45min,底物作用时间为15min。对60份临床样品的检测结果为2份阳性,58份阴性,与虎红平板凝集试验符合率98.33％。所以该方法可以作为犬布氏杆菌病的一个补充诊断方法。