研究背景:髓系细胞在众多重要生物学过程中包括宿主防御、组织再生及损伤修复中的作用突出而必不可少。髓系细胞由两类细胞组成,包括多形核细胞(嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞,肥大细胞)以及单核细胞/巨噬细胞(血液中的巨噬细胞,组织特异的巨噬细胞,树突状细胞)。这两类细胞在外形及功能上不尽相同,但它们都产生于两个相继且部分重叠的造血阶段:原始造血阶段,仅产生暂时的数量有限的髓系细胞及红系细胞;永久造血,能够永久产生并持续供应人体一生所需的所有血液细胞。髓系细胞通过称为“髓系形成”的过程发育成熟,其中包括中胚层细胞或造血干细胞特化成髓系祖细胞、髓系祖细胞向单核/巨噬细胞或粒细胞分化过程中命运的选择以及随后各类髓系细胞的各级成熟过程。髓系形成是一个复杂而有序的动态过程,其功能的正常发挥需要经过严密的转录因子控调才能得以实现。其中任何一个环节发生错误,都将引起造血异常造成血液疾病的发生。彻底地了解众多转录因子如何调控这些过程是明白及治疗相关疾病的基础。虽然在过去数十年对髓系细胞的形成、发育和成熟有大量的相关研究,但大部分都是对永久髓系造血的研究,且都是在小鼠和细胞上进行的,由于小鼠不透明,在体内检测小鼠胚胎时期的原始髓系细胞是非常困难的,而离体细胞又与体内状态相关甚远。使得在早期原始髓系造血中调控髓系生成、命运选择、特化、分化及成熟的基因调控网络知之甚少。斑马鱼作为模式动物,在国外研究已经超过40载,斑马鱼以其体积小、体外受精、身体透明、生殖力强等诸多生物学及遗传优势,迅速地应用到各个研究领域中来,如环境安全、药物筛选、发育生物学研究、免疫学研究、人类疾病研究等。斑马鱼用于研究髓系细胞发育以及髓系相关疾病,正是由于其得天独厚的优势。另外,髓系造血发育过程和细胞类型在斑马鱼中与哺乳动物十分相似,同样包含原始造血和永久造血两个阶段。后部侧向中胚层形成的中央细胞群是产生原始红系祖细胞的组织,而前部侧向中胚层被认为是原始髓系造血的部位。在受精后26h左右,造血干细胞的标记基因开始出现在背主动脉腹侧区域,标志着永久造血阶段在这里起始,这些造血干细胞随后逐渐迁移至尾部造血组织或在原位分化,最后定居在肾脏,为机体终生造血。并且,众多调节髓系发育的转录因子和信号通路也与哺乳动物相似。因此,斑马鱼是研究髓系形成、发育及成熟的极佳动物模型,对它的研究将有助于描绘人类髓系的调控网络。众多文献报道,c-MYB是一个重要的转录因子,最早是从鸟类成髓细胞增生症病毒分离出来的与v-MYB同源的原癌基因,位于人6号染色体,编码c-MYB蛋白,它具有高度保守的结构域,由3个主要的功能区构成:(1)位于氨基末端的DNA识别结合区,能识别并与特异的DNA序列相结合;(2)位于c-MYB蛋白中央的转录激活区,能够在c-MYB蛋白结合到下游基因启动子后促进下游靶基因的转录;(3)位于羧基末端的负性调控区,含有亮氨酸拉链,可与相对应的蛋白结合后抑制转录激活功能。c-MYB作为一种重要的转录因子参与了造血的各个过程,在祖细胞及造血干细胞中具有高表达,并随着细胞成熟及分化的进行,c-MYB的表达量逐渐减低。同时,c-MYB作为一个原癌基因,许多血液病可发现其活性异常。虽然已有大量文献报道关于c-MYB与各种血液系统疾病之间的关系,然而,c-MYB在这其中的病理学作用仍不清楚。c-MYB在早期造血中的作用提示,如果c-MYB调节异常将会导致一些血液病的发生,例如骨髓增生异常综合症、白血病、中性粒细胞颗粒缺陷综合症等等。而在禽类和鼠类中,c-MYB的异常激活会引起白血病转化。在小鼠中抑制c-MYB的活性可以抑制急性髓系白血病。临床上,在急性髓系白血病,急性淋系白血病以及慢性髓系白血病病人的白血病细胞中也发现了 c-MYB的高表达。总而言之,c-MYB在血细胞形成发育与血液疾病的发生中起到了关键的作用。然而,在动物模型中,c-MYB异常表达而直接导致血液病的调控机理依然缺乏。而缺少MDS向AML转化的动物模型也导致追踪MDS向AML转化的病程及机理相当困难。c-MYB也与其他转录因子通过协同或拮抗作用,共同来调控血液细胞的增殖与分化。c-MYB与造血发育关系十分密切,它在造血过程中的各个阶段以及各个谱系中都有参与。原始髓系造血是脊椎动物胚胎发育的重要步骤,尽管已知数个转录因子参与调控,但原始髓系造血调控机制目前仍不明确。c-MYB除了对造血干细胞的形成、维持及发育有影响外,我们发现c-Myb还调控着原始造血中的髓系发育,这在以往的小鼠模型及细胞中少有报道的。CCAAT 增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein,C/EBP)家族是碱性亮氨酸拉链蛋白家族的成员,在机体细胞的形成、增殖、分化、肿瘤及免疫、代谢等方面发挥重要的影响。目前在哺乳动物里发现六个成员,C/EBPα,C/EBPβ,C/EBPγ,C/EBPδ,C/EBPε,C/EBPξ。而大部分 C/EBP 家族成员在斑马鱼中都可以找到其序列同源的基因。cebp1编码与哺乳动物C/EBPs同源的一个蛋白质,其羧基末端也有一个碱性亮氨酸拉链区域,但是氨基末端与C/EBPs已知的序列不同源。已经明确斑马鱼C/ebp1在胚胎发育的髓系细胞中特异表达且与中性粒细胞中的lysozyme C(lyz)的形成相关。但是其功能方面的报道却寥寥无几,目前认为斑马鱼中C/ebp1和哺乳类动物中的C/EBPε功能相似,很可能发挥着与C/EBPε 一样的作用。C/EBPε主要在中性粒细胞中表达,不仅在粒细胞不成熟阶段向成熟阶段发展中发挥相当重要的作用,而且在单核巨噬/粒细胞谱系命运的选择过程中也起着重要作用。本论文分为三章:第一章为正向遗传学及反向遗传学获得髓系缺陷的相关突变体;我们通过大规模正向遗传学筛选获得髓系特异基因lysozyme C缺陷的突变体cmybhk=3及利用TALEN定点敲除技术获得cebp1smul突变体。第二章为c-Myb和C/ebp1调控斑马鱼粒细胞成熟的机制;我们从分子水平、细胞水平和遗传通路三方面,分别对cmybhk=3及cebp1smul单突变体和双突变体进行表型分析,证实c-Myb与C/ebp1存在协同作用,共同促进lysozyme C基因的表达,从而调控斑马鱼粒细胞的成熟过程。第三章为c-myb和cebp1异常表达可导致斑马鱼髓系发育异常疾病。我们发现,在cmybhk=3及cebp1smul广突变体中,粒细胞成熟受到阻碍,表现为粒细胞特异的颗粒酶lysozyme C显著降低,苏丹黑B(SB)阳性细胞数量减少,微分干涉相差显微镜(differential interference contrast,DIC)观察显示粒细胞表面颗粒减少,而巨噬细胞和其它造血谱系并未受到影响,类似于人类中性粒细胞颗粒缺陷(neutrophil-specific granule deficiency,SGD)综合症。另外我们发现,c-mnb异常表达的转基因斑马鱼c-myb-gfp AE中出现髓系异常增生的表型,而在人类多种血液病中(如急性白血病、慢性白血病、髓系异常增生综合症)都会发现伴随有c-MYB异常表达或异位表达。因此,我们期望通过我们现有的各种c-myb和cebp1基因异常表达的斑马鱼,建立类似于人类髓系发育异常的斑马鱼疾病模型,以期能够从中找到c-Myb和C/ebp1调控中性粒细胞发育成熟以及失调控后髓系疾病形成的机理,对人类中性粒细胞的成熟过程有更深入的了解。有望揭示未曾报道的中性粒细胞发育的分子机理及遗传学通路,并为探索人类相关疾病的机理做出贡献。第一章正向遗传学及反向遗传学获得髓系缺陷的相关突变体1.目的1)本章介绍利用正向遗传学大规模ENU诱变筛选髓系特异基因lysozyme C缺陷的突变体,定位克隆并测序基因后命名为cmybhk=3。2)利用TALEN反向遗传学技术敲除cebp1基因获得突变体并命名为cebp1smul突变体。2.方法1)我们采用ENU诱变方法,处理40条AB野生型斑马鱼雄鱼,将存活的雄鱼与AB野生型雌鱼交配产生F1代,然后F1代自交产生F2代。收集F2代同家族自交产生的F3代胚胎,通过lysozyme C原位杂交的方法,筛选出lysozyme C缺陷的突变体,并通过基因定位克隆的方法,找到该突变体的基因突变位置并测序鉴定。2)我们根据cebp1第二个外显子的目标序列设计靶点,靶点序列包含一个FaqI酶切位点,这个酶切位点用来鉴定突变。公司合成TALEN质粒后用SP6转录酶体外合成加帽的TALEN mRNA,将编码TALEN的mRNA通过显微注射的方式注入斑马鱼胚胎中,导致cebp1基因目标序列处双链断裂,经过损伤修复后产生插入或缺失突变,从而导致蛋白翻译提前终止,起到敲除cebp1基因的作用,最后通过FaqI酶切筛选后测序,获得cebp1基因缺陷的斑马鱼突变体。(本部分与赵灵凤博士共同完成)3.结果1)经过ENU诱变处理后,将存活的雄鱼与野生型AB雌鱼交配,得到20个F1代家族,约2000条。进而将F1代自交,得到1564个F2家族。我们用整体原位杂交大规模筛选了 1383 个F2家族,得到粒细胞特异基因lysozyme C缺陷的突变体,接着对这些突变体用其它血液谱系标记物进行大致的表型鉴定,然后挑选其中一个突变体230进行基因定位克隆,测序确定其为c-myb基因突变,并命名为cmybhk=3。2)利用TALEN技术,设计能够特异识别cebp1目标序列的TALEN,合成TALEN质粒后用SP6转录酶体外合成加帽的TALEN mRNA,将编码TALEN的mRNA通过显微注射的方式注入斑马鱼胚胎中,导致cebp1基因产生插入或缺失突变,从而导致蛋白翻译提前终止,起到敲除cebp1基因的作用,最后通过酶切筛选,获得cebp1基因缺陷的斑马鱼突变体cebp1smul。4.结论1)我们通过ENU化学诱变,成功筛选到斑马鱼髓系特异基因lysozyme C缺陷突变体,这表明ENU诱变筛选是一种成熟且高效的正向遗传学筛选方法。从中选取一个突变体进行基因定位克隆,测序确定其为c-myb基因突变,并将其命名为cmybhk=32)利用TALEN技术,设计能够特异识别cebp1目标序列的TALEN,将编码TALEN的mRNA通过显微注射的方式注入斑马鱼胚胎中,通过酶切筛选,能够高效地获得cebp1基因缺陷的斑马鱼突变体,并命名为cebp1smul。第二章c-Myb和C/ebp1调控斑马鱼粒细胞成熟的机制1.目的1)通过各种表型分析检测方法,对cmybhk=3及cebplsmul突变体进行较为详细的表型鉴定,初步确定c-Myb及C/ebp1作用于造血发育过程中的哪个阶段。2)希望通过在分子水平、细胞水平、遗传通路三方面了解c-Myb和C/ebp1在斑马鱼粒细胞成熟过程中调控的机理。2.方法1)我们利用原位杂交来检测cmybhk=3及cebp1smul突变体中造血各谱系发育标记基因的表达情况。包括21hpf(hours post fertilization)标记原始髓系造血的pu.1,30hpf 标记原始巨噬细胞的csflra,3dpf(days post pertilization)标记原始小胶质细胞的apoeb,36hpf标记中性粒细胞的mpx,lyz 36hpf标记原始巨噬细胞的mfap4的表达,3dpf标记脑部小胶质细胞的中性红染色,22hpf标记原始中性粒细胞的cebp1。(此部分工作由金皞博士完成)2)利用微分干涉相差显微镜和苏丹黑B化学染色观察cmybk=3及cebp1smul突变体中性粒细胞的细胞成熟状况。3)利用显微注射技术导入质粒pTol-hs70:Myc-cmyb 及pTol-hs70:cebp1-eGFP来进行cmybhk=3突变体和cebp1sul突变体的拯救实验(cmybhk=3突变体拯救实验由张译月教授早期完成)。4)我们采用cmybhk=3及cebp1smul双突变体的策略,观察双突变体中相对于单突变体及野生型中的lyz,mpx,苏丹黑B的表达情况和微分干涉相差显微镜下中性粒细胞表面颗粒的情况。5)利用在线软件预测lysozyme C-2.5kb启动子上c-Myb和C/ebp1的结合位点,并通过overlap PCR的方法,分别克隆c-Myb和C/ebp1的结合位点突变的启动子,重组到带有GFP报告蛋白的载体上,分别为:pTo1-lyz:eGFP、pTol-lyz(mMBS):eGFP、pTol-lyz(mCBS):eGFP 以及pTol-lyz(mMBS+mCBS):eGFP,通过观察GFP的表达情况,初步证明c-Myb和C/ebp1是否通过结合到lyz启动子上并共同促进其表达。6)另外,利用染色质免疫共沉淀技术和蛋白免疫共沉淀技术,进一步确定c-Myb和C/ebp1蛋白是否直接结合在lyz预测的启动子上并且两个蛋白之间也相互结合。(c-Myb免疫共沉淀由张译月教授早期完成)7)在cmybhk=3及cebp1smul突变体中利用显微注射的方法注入重组质粒pTol-efla:lyz过表达lyz,观察是否能够恢复cmybhk=3及cebp1smul突变体中苏丹黑B染色阳性的细胞数。3.结果1)我们分别对两种突变体进行了原位杂交的表型分析,结果显示,cmybhk=3及cebp1Smul突变体中单核/巨噬系,髓系祖细胞,中性粒细胞的前体细胞发育基本不受影响,而只有较成熟中性粒细胞特异的基因受到影响。值得注意的是lyz的表达在这些基因中受到的影响最大。2)微分干涉相差显微镜和苏丹黑B染色结果显示在cmybhk=3及cebp1smul突变体中中性粒细胞表面颗粒减少,苏丹黑B染色阳性细胞数显著减少且染色减弱。3)拯救实验的结果表明,使用质粒pTol-hs70:cebp1-eGFP直接导入cebp1smul突变体中,在热刺激下能够恢复的lyz的表达。4)我们发现在cmybhk=3及cebp1smul双突变体中,lyz,mpx,苏丹黑B的阳性细胞数量均比单突变体及野生型都有所降低,微分干涉相差显微镜下中性粒细胞表面颗粒在双突变体中也要少于单突变体及野生型。5)我们通过软件TFsearch在线软件预测出在lyz-2.5kb启动子中有7个c-Myb的可能结合位点,2个C/ebp1的可能结合位点(KitaguchiT已报道),并通过overlap PCR的方法,分别克隆c-Myb和C/ebp1的结合位点突变的启动子,重组到带有GFP报告蛋白的载体上,结果表明,注射c-Myb和C/ebp1结合位点同时突变的载体在四个组中GFP的表达量最低,而注射c-Myb和C/ebp1结合位点单突变载体比注射无突变的lyz启动子的载体GFP的表达量下降。6)染色质免疫共沉淀结果表明,c-Myb和C/ebp1蛋白分别直接结合在lyz预测的启动子上;而蛋白免疫共沉淀结果则表明c-Myb和C/ebp1蛋白之间也相互结合。7)在cmybhk=3突变体中过表达lyz,并不能拯救cmybhk=3突变体中减少的SB染色阳性的细胞数量,而在cebp1smul突变体中过表达lyz,能够拯救cebp1smul突变体中减少的苏丹黑B染色阳性细胞数量。4.结论:1)cmybhk=3及cebp1smul突变体中单核/巨噬系,髓系祖细胞,中性粒细胞的前体细胞发育基本不受影响,而只有较成熟中性粒细胞特异的基因受到影响。这说明cmybhk=3及cebp1smul突变体中中性粒细胞的发育过程中受到了遏制,而不是整个细胞谱系受影响。而lyz缺陷程度最高,提示lyz很可能是c-Myb和C/ebp1的直接靶蛋白。2)微分干涉相差显微镜观察和苏丹黑B化学染色表明,在cmybhk=3及cebplsmul突变体中中性粒细胞发育并不成熟,这可能与中性粒细胞的成熟过程受阻有关。3)拯救实验证明cmybhk=3和cebp1smul突变体的表型确是由于c-myb和cebp1缺失导致。4)通过对cmybhk=3及cebp1snul双突变体进行表型分析,我们发现在原始造血阶段中性粒细胞的发育成熟过程中,c-Myb与C/ebp1协同参与了调控。5)通过转录因子结合位点预测实验,我们可以得出结论:c-Myb和C/ebp1通过直接结合到lyz的启动子上且相互结合来共同促进lyz mRNA的表达。6)lysozyme C很可能是影响cmybhk=3和cebp1smul突变体中粒细胞成熟过程中的关键因子,在cmybhk=3突变体中过表达lyz,并不能拯救cmybhk=3突变体中减少的SB染色阳性的细胞数量,而在cebp1smul突变体中过表达lyz,能够拯救cebp1smul突变体中减少的苏丹黑B染色阳性细胞数量。说明c-Myb下游很可能还存在其它影响中性粒细胞成熟的靶基因或c-Myb相对于C/ebp1中处于更加关键的位置。第三章c-my章和cebp1异常表达可导致斑马鱼髓系发育异常疾病1.目的1)通过原位杂交,SB染色等检测方法,对c-myb异常激活的转基因斑马鱼c-myb-gfp进行表型分析。2)我们希望通过对cmybhk=3、cebp1smul突变体、c-myb异常激活的转基因斑马鱼比对人类相关疾病,建立类似于人类髓系发育异常的疾病的斑马鱼物模型。2.方法我们通过原位杂交,SB染色等检测方法,对c-myb异常激活的转基因斑马鱼c-myb-gfp髓系造血发育各阶段标记基因进行表型分析。包括36hpf c-myb,3dpf c-myb,5dpf c-myb,3dpf cebpa,3dpf mfap4,3dpf lyz,3dpf SB 7dpf SB(此部分与刘伟博士、吴媚硕士共同完成)。通过查阅文献以及与临床医师交流,对cmybhk=3、cebp1smul突变体、c-myb异常激活的转基因斑马鱼和人类相关疾病比较。3.结果1)整体原位杂交结果发现c-myb基因在c-myb-gfp转基因斑马鱼中的表达异常增多。2)整体原位杂交结果显示髓系前体细胞标记基因cebpα以及中性粒细胞标记基因lyz阳性细胞显著增多,而标记巨噬细胞的mfap4阳性细胞减少。而SB染色结果不仅表明c-myb-gfp妳转基因斑马鱼中粒细胞数量增多,而且粒细胞的外形异常,表现为体积变大、染色更深。4.结论:1)本章介绍了一种由于c-myb异常激活的转基因斑马鱼c-myb-gfb,c-myb表达异常可引起斑马鱼在胚胎时期出现异常激活的髓系造血。2)通过对cmybhk=3、cebp1smul突变体和c-myb异常激活的斑马鱼表型比对,我们发现,cmybhk=3和cebp1smul突变体表型与人类中性粒细胞颗粒缺陷(neutrophil-specific granule deficiency,SGD)综合症相似;而 c-myb 异常激活的斑马鱼的表型与人类骨髓增生异常综合征(MyeIoDysplastic Syndrome,MDS)相似。