论文部分内容阅读
二化螟属于鳞翅目螟蛾科,在中国,是水稻上重要的钻蛀性害虫之一。分布广泛,危害严重,除了危害水稻外,还能危害茭白等其他作物。在中国,常用化学药剂来防治二化螟,长期连续的使用杀虫剂,必然使二化螟对许多常规药剂产生了不同水平的抗性。为了延缓抗药性的发展,亟需建立有效合理的抗性治理策略。研究二化螟抗药性分子机制对于抗性治理策略的发展是非常重要的。本文监测了不同地区二化螟对几种常见杀虫剂的抗性,对二化螟酯酶基因进行了克隆和分析,协作完成了二化螟解毒酶基因的组学分析,包括P450(CYP)基因和谷胱甘肽-s转移酶(GST)基因,同时通过诱导实验研究了二化螟167条解毒代谢酶基因对醚菊酯的诱导响应,比较了不同抗性的二化螟种群中差异表达的解毒酶基因。本研究为阐明二化螟在中国的抗性状况和制定有效的抗药性监测治理措施奠定了基础。1.二化螟对醚菊酯抗性的调查分析首先利用野外种群和室内敏感种群研究比较了两种测定螟虫抗药性的方法,结果表明,初孵幼虫药膜法不仅简便,而且反映二化螟的田问抗药性更灵敏,可用于二化螟的抗性监测。接着用初孵幼虫药膜法测定了我国7个不同地区二化螟对醚菊酯、丁烯氟虫腈、阿维菌素及三唑磷的抗性水平,结果表明,以室内敏感品系为对照,我国多数稻区的二化螟对三唑磷均产生了高水平抗性(48.0≤RR≤128.8),仅有四川万州等少数地区处于敏感-敏感下降水平(1≤RR≤4.0)。对丁烯氟虫腈和阿维菌素,尚没有发现显著的抗性(0.1≤RR≤2.7),但不同地区种群对丁烯氟虫腈的耐药力差异较大,其原因有待进一步分析。不同地区二化螟对醚菊酯的抗性与阿维菌素类似,仅有扬州地区和浙江金华地区种群的二化螟表现为低水平抗性外(6.6≤RR≤8.8),其他地区的二化螟均处于敏感-敏感性下降阶段(0.6≤RR≤3.8)。由此认为,多数地区二化螟对生产中使用历史较长的有机磷类杀虫剂三唑磷普遍产生了高抗,对新药或杀虫机理独特的药剂,抗性不明显。醚菊酯作为钠离子通道效应剂,可以用来增加防治螟虫药剂的多样性,以便在生产中通过轮换和混用,延缓抗性的发生发展。但其室内测定毒力较其他药剂差,田间应用尚需验证田间药效。2.二化螟酯酶基因的克隆和分析酯酶(EST)是三种主要解毒代谢酶的重要一员,本研究在实验室已有工作的基础上,利用二化螟的转录组和基因组数据,搜索验证获得了28条新的EST基因,加上实验室成员之前所验证的17条酯酶基因,目前共发现45条酯酶基因,通过对这45条酯酶基因进行B1astX,得出了45条二化螟酯酶基因与其他物种中相似度最高的酯酶基因,接着对已有大于350 aa的EST基因进行进化树分析发现,二化螟EST基因27条长序列中有7条与棉铃虫EST基因有对应的同源基因,有1条与烟青虫EST基因有对应的同源基因,表现出明显的亲缘和适应进化关系。通过合作完成了二化螟三种解毒酶基因的组学分析,共鉴定了167种解毒酶基因,为进一步深入研究二化螟解毒酶基因家族中各基因的具体功能奠定了基础。3.醚菊酯对二化螟解毒代谢酶系基因的诱导作用外源化合物可以诱导昆虫体内的代谢酶,本研究通过亚致死剂量处理二化螟,分析了醚菊酯对二化螟P450、EST和GST基因的诱导效应。利用半定量PCR技术检测发现有16条P450基因和14条EST基因诱导后表达上调。利用荧光定量PCR技术进一步验证发现上调2倍以上,且与对照差异显著的有8条酯酶基因和3条P450基因,它们分别为CsuEst.3(2.1倍).CsuEst.4(2.6倍)、CsuEst-7(214倍).CsuEst-15(3.0倍).CsuEst-24(2.2倍).CsuEst-25(2.1倍).CsuEst-37(4.2倍)、CsuEst-44(3.0倍)、CYP341(4.5倍).CYP341B(2.5倍)和CYP304F13(2.0倍)。本研究初步认为,这些解毒酶基因可能参与了醚菊酯的解毒代谢。4.醚菊酯抗性二化螟的代谢酶基因表达差异依据抗性监测结果,选取了对醚菊酯具有不同抗性水平的地理种群,以室内敏感品系(RR=1)为对照,比较检测了南昌(RR=1.2)和金华(RR=8.8)等不同抗性水平的地理种群中代谢酶的表达状况。首先通过半定量PCR技术对45条酯酶(CusEst)基因,96条P450基因及26条谷胱甘肽-s转移酶(GST)基因进行筛选,接着利用荧光定量PCR技术验证半定量筛选出的表达差异的基因。结果没有发现与醚菊酯抗性相关的解毒酶基因,这一方面是因为研究种群的醚菊酯抗性较低,另一方面是因为野外种群遗传背景复杂,基因表达的影响因素较多,分析解毒酶与抗药性的关系受到多种因素的干扰。但本研究发现金华和南昌2个野外种群共同上调的解毒酶基因有2个,即CsuEstl 4和CYP6AB50,为进一步深入研究野外种群对其他杀虫剂抗性的分子机理奠定了一定的基础。