结核分枝杆菌(MTB)是人类重要病原菌之一,全世界大约有三分之一的人口遭受感染。近年来,多耐药(MDR)和泛耐药(XDR)MTB的出现,向结核病治疗提出了严峻的挑战。随着结核分枝杆菌耐药性的出现和日益加重,对菌株耐药性的快速检测在临床上具有重大意义。目前平板生长药敏试验是一种标准方法,但平板生长法太慢(3-4周),不能快速得到患者所感染结核菌的耐药谱,使病人不能得到及时治疗。如果能够找到结核分枝杆菌增殖较慢的根本原因,并针对性地采取措施,对于结核菌耐药性检测无疑是一个重大突破。　　 导致结核分枝杆菌增殖慢的因素较多,但其DNA、RNA和蛋白质合成速率是关键因素,即DNA复制、转录和蛋白质翻译等分子事件至关重要。因此,负责DNA新链合成的聚合酶体系的结构与功能信息会为揭示此问题提供重要依据。结核分枝杆菌基因组中有两个DNA聚合酶(PolⅢ)α亚基基因(dnaE1和dnaE2)。dnaE1基因缺失是致死性的,因此,这个基因被认为是主要的DNA复制聚合酶。本论文以结核分枝杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能为切入点,对结核分枝杆菌的基因组稳定、生长缓慢和耐药性产生机制深入研究,从而加深理解基因组稳定与病原菌产生耐药性的关系,为结核分枝杆菌的耐药性快速诊断、开发新的抗结核药物提供理论依据,这不仅是基本的生命科学问题,也是人类重大传染病防治领域研究的重要课题之一。　　 在E.coli中,基因组复制由DNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)负责,它由三个组件构成,即复制核心(replication core)、钳装载器(clamp loader)和滑动钳(sliding clamp)。MTB基因组测序的结果表明,MTB的DNA polⅢ也由这三部分组成。本研究以MTB H37Rv的DNA polⅢ为研究对象,从结构和生化的角度展开研究。　　 通过X射线衍射的方法成功解析出MTB H37Rv的DNA polⅢ重要亚基β clamp的晶体结构,分辨率为2.9埃。该结构呈头-尾相连的环状形式,与E.coliβ clamp晶体结构类似,整个环的直径大约为80 A,直径为35 A,但N-terminal face的负电势比E.coli的更强。根据晶体结构,设计源自MTBα和δ的不同小肽,研究它们与β clamp的相互作用和动力学常数。应用分析型超速离心方法确定了β在溶液中以二聚体的形式存在,通过Far-western方法确定了β clamp与t存在相互作用。　　 建立了E.coli DNA polⅢ的replication core和clamp loader的共表达纯化系统,简化了表达纯化和组装过程,缩短了实验流程。采用缺口双链DNA作为底物和低电压核酸琼脂糖电泳,建立了E.coli DNA polⅢ酶活检测体系,为建立TB DNA polⅢ的体外酶活系统、以及其它复杂酶体系,提供了有益的参考和借鉴。　　 获得了MTB DNA polⅢ所有亚基的克隆,应用共表达方法,表达和纯化clamp loader并测定其ATP酶活和clamp loading活性。通过IPTG诱导的GroESL分子伴侣系统和阿拉伯糖诱导的araBAD启动子表达载体的分步表达,成功解决了DNApolⅢε亚基的可溶性表达,获得了ε蛋白。利用NEB Impact系统和大纯化标签载体解决了TB DNA聚合酶Ⅲ的α亚基的可溶表达问题。　　 综上,本研究通过对MTB DNApolⅢ的β亚基晶体结构及其它亚基的生化性质的研究,为结核分枝杆菌DNA聚合酶的深入研究打下基础,也为结核病新药的研发提供了一些理论依据。