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目的:本研究以长期暴露于高原环境的移居者为研究对象,观察人体主要生理和代谢指标,以及其它系统中主要指标发生的变化,分析慢性高原病发生的危险因素;观察缺氧条件对血管平滑肌细胞的影响,以期揭示慢性高原病中血压升高的发病机制;初步观察中医药干预慢性高原病的疗效。为防治本病提供思路和方法。方法:1.临床观察采用开放、单臂、自身前后对照设计的临床观察方法,纳入了160例由平原地区前往高海拔地区工作的受试者。合格受试者于进入高海拔环境后第1年时进行主要生理和代谢指标检测,包括体重、血压、血脂、血糖,以及循环系统、神经系统、血液系统、消化系统等主要指标的检测,观察其与基线值的变化情况。合格受试者在进入高原环境后第2年时采用青海CMS记分系统评估CMS发生率和严重程度;分析年龄、性别、海拔高度等因素与主要观察指标的相关性。本试验已于Clinicaltrial.gov网站注册,NCT编号为03446898。2.细胞实验采用A7r5大鼠胸大动脉平滑肌细胞,设置常氧对照组和缺氧组,定量实时聚合酶链反应(quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)观察血管平滑肌细胞功能相关基因ACTG2、GNA11、CALM2、PRKX、Rhox和ROCK的mRNA表达水平变化,筛选待调控基因。随后,设置6个实验组,分别为常氧组、缺氧组、常氧组+siR-NC、缺氧组+siR-NC、常氧组+siR-目标基因、缺氧组+siR-目标基因组,采用siRNA抑制处理各组。最后,采用胶原凝胶实验观察目标基因的血管收缩情况;采用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)观察目标基因、血管张力决定因子(pMLC)和收缩标志物(KV1.5)的表达变化;采用免疫细胞化学检测法(Immunocytochemistry,ICC)检测pMLC的表达。3.中医药干预采用中医药理论知识,分析慢性高原病的发病机制、病理因素和辨证施治,初步观察中药干预慢性高原病的疗效。结果:1.临床观察(1)血压:高海拔环境暴露1年后,受试者的收缩压和舒张压均明显升高,分别由基线的122.02±13.54 mmHg和78.31±10.43 mmHg上升至126.06±19.92mmHg和83.25±14.77 mmHg,差异显著(P=0.030;P=0.001)。(2)体重:受试者体重轻微下降,由基线的73.06±9.60 Kg下降至72.64±9.82 Kg,改变不明显(P>0.05),BMI也呈下降趋势,由基线的24.73±2.33下降为24.56±2.38,改变不明显(P>0.05)。(3)血脂:受试者甘油三酯上升,由基线的1.84±1.07 mmol/L上升为2.17±1.41 mmol/L,差异显著(P<0.001);受试者总胆固醇表现出升高的趋势,由基线的5.03±0.91 mmol/L上升为5.15±0.92 mmol/L,差异不明显(P>0.05);受试者高密度脂蛋白胆固醇呈下降趋势,由基线的1.21±0.25 mmol/L下降为1.20±0.27 mmol/L,差异不明显(P>0.05);受试者低密度脂蛋白胆固醇呈上升趋势,由基线的3.00±0.82 mmol/L上升为3.05±0.83 mmol/L,差异不明显(P>0.05)。(4)血糖:受试者空腹血糖和HbA1c表现出升高的趋势,分别由基线的5.24±0.79 mmol/L和5.51±0.50%上升为5.36±0.70 mmol/L和5.67±0.40%,呈上升趋势,差异不明显(P>0.05;P>0.05)。(5)风险因素:logistic回归分析方法显示,年龄、性别、海拔高度和基线BMI与主要观察指标变化的相关性不显著。在排除了年龄、性别和BMI等混杂因素之后,与基线血脂正常人群相比,基线血脂异常人群在高海拔环境中暴露1年以后血脂异常的风险是前者的7.04倍,差异显著(P<0.001),提示基线血脂异常者一年后出现血脂异常的风险增加。在排除了年龄和BMI等混杂因素之后,与基线血糖正常人群相比,基线血糖异常人群在高海拔环境中暴露1年以后再次发生血糖异常的危险性是前者的13.84倍,差异显著(P<0.01),提示基线血糖异常者一年后出现血糖异常的风险增加。(6)其它系统:其它各系统也表现出部分典型的病理改变。2.细胞实验(1)胶原凝胶(细胞外基质)实验:在缺氧条件下,siR-CALM2组中的胶原凝胶直径明显大于对照组和siR-NC组,差异显著(P<0.05),而对照组和siRNC组之间平均胶原凝胶直径无统计学差异;在常氧条件下,对照组、siR-NC组和siR-CALM2组中平均直径无统计学差异。与常氧条件下同组相比,缺氧处理后,对照组和siR-NC组的胶原凝胶直径明显降低(P<0.05);而siR-CALM2组的缺氧和常氧条件下平均胶原凝胶直径无统计学差异。意即,缺氧能够促进胶原凝胶收缩,而抑制CALM2后能够显著抑制凝胶收缩。(2)WB实验:常氧条件下,siR-CALM2组中CALM2的蛋白水平明显较对照组和siR-NC组低(P<0.05),而后两者相比无统计学差异;缺氧条件下,siR-CALM2组中CALM2的蛋白水平明显较对照组和siR-NC组低(P<0.05),而后两者相比无统计学差异;与常氧条件相比,各组细胞在缺氧条件下的CALM2蛋白水平均显著升高(P<0.05);常氧条件下,siR-CALM2组中KV1.5的蛋白水平明显较对照组和siR-NC组低(P<0.05),而后两者相比无统计学差异;缺氧条件下,siR-CALM2组中KV1.5的蛋白水平明显较对照组和siR-NC组低(P<0.05),而后两者相比,无统计学差异;与常氧条件相比,各组细胞在缺氧条件下的KV1.5蛋白水平均显著升高(P<0.05);常氧条件下,siR-CALM2组中pMLC的蛋白水平明显较对照组和siR-NC组低(P<0.05),而后两者相比无统计学差异;缺氧条件下,siR-CALM2组中pMLC的蛋白水平明显较对照组和siR-NC组低(P<0.05),而后两者相比,无统计学差异;与常氧条件相比,各组细胞在缺氧条件下的pMLC蛋白水平均显著升高(P<0.05);WB实验结果表明,缺氧条件下,抑制CALM2后,其基因和收缩功能相关的pMLC和KV1.5蛋白表达均显著下调。(3)ICC检测:与常氧相比,缺氧条件下对照组和siR-NC组中的细胞周围表达更多的pMLC。缺氧条件下,pMLC存在强烈的细胞溶质染色。意即,CALM2对平滑肌细胞收缩功能的调节主要定位在细胞质。3.中医药干预气虚血瘀证为慢性高原病主要证型,补益中气、活血化瘀为基本原则。西洋参和藏红花为代表的中药组方对改善慢性高原病有一定疗效。结论:1.与平原地区的相应基线指标相比,长期(1年)暴露于高海拔环境中的受试者其收缩压和舒张压均升高,差异显著;血脂呈代谢紊乱趋势(甘油三酯显著上升、总胆固醇升高、高密度脂蛋白胆固醇下降和低密度脂蛋白胆固醇升高);血糖和HbA1c呈升高趋势,无统计学上的显著差异;2.与基线血脂正常和血糖正常的人群相比,基线血脂异常和基线血糖异常人群在高原环境中居住1年后,出现血脂异常和血糖异常的危险性分别是前者的约7倍和13倍,差异显著。基线血脂和血糖异常的受试者暴露于高海拔环境中,其再次发生代谢紊乱的风险高于基线正常的受试者,差异显著;3.其它各系统也表现出部分典型的病理改变;4.缺氧条件下,大鼠胸大动脉平滑肌细胞A7r5中的CALM2基因明显上调;抑制该基因后,pMLC和KV1.5等相关收缩因子的表达下调,且能明显改善细胞外基质收缩力,表明CALM2在平滑肌细胞收缩过程中发挥作用;5.初步观察中医药干预对改善慢性高原病有一定疗效。