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酿酒酵母本身具有两个编码环腺苷酸(cAMP)磷酸二酯酶的基因PDE1和PDE2。它们分别编码低亲和力的cAMP磷酸二脂酶Pde1和高亲和力的cAMP磷酸二脂酶Pde2。低亲和力磷酸二脂酶Pde1在由葡萄糖所诱导的酿酒酵母细胞cAMP信号反应过程中起反馈抑制的作用。Pde1的酶活性是受到PKA磷酸化调节的。但以往的研究发现:在胞外试验中,磷酸化纯化的Pde1并不能改变它对cAMP的低亲和力性或激活其降解cAMP的活性。因此,很可能磷酸化的作用在于使Pde1酶定位于胞内特定的位点,而cAMP趋向于在该位点被降解。本课题研究是先在大肠杆菌与酵母的穿梭质粒YCplac33的多克隆位点上构建PDE1与GFP(编码绿色荧光蛋白)融合基因。再将这一新构建质粒V410导入基因组PDE1基因缺失的菌株YN123、YN100和YN101。菌株YN123的PKA水平是组成型降低的;菌株YN100的PKA水平正常;菌株YN101的PKA水平是组成型升高的。将这些菌株在以甘油(非发酵性碳源)为碳源的合成培养基中培养至对数生长期时,加入葡萄糖诱导细胞。通过免疫荧光检测的方法,检测细胞内Pde1-GFP融合蛋白的细胞内定位。研究发现:生长在非发酵性碳源培养基中的菌株YN123和菌株YN100其Pde1蛋白定位在细胞质内,很有可能集中在内质网或高尔基体上。其中葡萄糖诱导菌株YN123之后,细胞内Pde1-GFP融合蛋白的定位没有明显地变化;葡萄糖诱导菌株YN100之后,细胞内的Pde1-GFP融合蛋白从集中于细胞质内特定的位点(内质网或高尔基体)扩散到细胞质中;而在葡萄糖诱导菌株YN101前后,Pde1-GFP融合蛋白均稳定在细胞质中。这一结果暗示在低PKA活力的细胞(细胞生长在非发酵性碳源培养基中或是胞内PKA水平组成型降低)中,未被磷酸化的Pde1会从细胞质中汇集到内质网或高尔基体上以防止其降解胞内的cAMP;另一方面,在高PKA活力的细胞(细胞生长在葡萄糖培养基中或胞内PKA水平组成型升高)中,Pde1将被磷酸化,并且定位于细胞质中水解cAMP。研究过程中同时发现:在葡萄糖诱导5分钟以后,Pde1-GFP融合蛋白以点状散布在细胞质内。这一现象与生长在非发酵型碳源培养基中的菌株YN123和菌株YN100细胞内Pde1-GFP融合蛋白定位情况类似。这就与先前研究成果相一致即:酵母细胞在葡萄糖上一旦开始发酵型生长,Ras-cAMP通路便会被关闭,另一通路FGM将会取代PKA的作用去激活PKA的目标蛋白。Sch9是目前唯一所知的FGM通路的组分,它对PKA的活力有抑制作用。因此,葡萄糖的加入激活了FGM通路,导致PKA活力的降低,Pde1磷酸化水平下降。研究过程中发现:在已经出芽的酿酒酵母细胞中,Pde1更加集中于芽,并且在芽中则趋向于集中到芽生长位点的顶部。这暗示:Pde1趋向于集中到细胞生长