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肺动脉高压(pulmonary Arterial Hypertension，PAH)是以肺动脉压力增高为特征的一类疾病，其发病机制至今仍不明了。已知血管重构是肺动脉高压的重要病理特征，其主要病理改变是血管平滑肌层增厚造成管腔狭窄、闭塞。肺血管重构可引起肺动脉压力升高，肺血管阻力增大而加重右心室后负荷，严重时导致右室肥厚、心力衰竭甚至死亡。延缓肺血管重构，改善心肺功能是药物治疗肺动脉高压，提高患者生存率的关键靶点。 骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)是转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF)超家族成员之一。BMP可结合位于细胞膜上的丝氨酸/络氨酸受体复合物（由BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ组成，进而磷酸化激活胞内Smad信号分子，SmadS入核启动下游基因表达。研究发现，骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPR-Ⅱ)突变是导致遗传性肺动脉高压的主要发病因素，也发现于25％左右的特发性肺动脉高压患者。在低氧诱导和野百合碱注射诱导的肺动脉高压动物模型也发现BMPR-Ⅱ表达下调，BMP信号通路功能受损。因此，BMP信号通路被认为是PAH发生发展的重要调节通路，其中的BMP-2信号通路可恢复细胞凋亡和增殖的平衡状态，显著改善肺血管重构，在细胞凋亡、增殖和转化中担当着重要的调控作用。研究表明，BMP-2信号是维持内皮细胞正常功能的重要因素。 脂肪组织来源的间充质干细胞(Adipose Derived Stromal Cells，ADSCs)是一种来源于脂肪可以向中胚层多种细胞诱导分化的多能干细胞，因其取材简单，创伤小，少量脂肪组织即可获取大量细胞，体外培养方便，扩增容易而倍受研究者的关注，而且体外研究指出ADSCs可以分泌大量的促血管新生的细胞因子如肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，血管内皮生长因子(Vascular EndothelialGrowth Factor，VEGF)等。将ADSCS用于缺血性疾病取得了满意的结果，更有研究将该种细胞用于肺损伤模型，如肺气肿的动物模型，依靠ADSCs的多向分化功能和/或其分泌作用增加肺组织的血管及腺泡的生成和修复，从而改善了肺组织的血流灌注和换气功能。 本研究以此为切入点，将ADSCs与BMP-2相结合，通过对大鼠野百合碱诱导的肺动脉高压治疗及机制的探讨，以证实转染BMP-2基因ADSCs细胞移植在减少肺血管重构、减轻炎症反应、修复肺组织损伤方面所起的作用。 材料和方法： 雄性成年SD大鼠购于中国医科大学动物实验中心，8-10周龄，体重220-250g，10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔麻醉。 实验一:于严格无菌条件下取大鼠腹股沟脂肪组织，剪碎后用胶原酶消化，反复过滤离心获取ADSCS，体外培养观察细胞形态，并进行表型和功能鉴定。将构建的慢病毒eGFP-BMP-2基因载体转染ADSCs，荧光显微镜下观察转染情况，检测细胞的BMP-2蛋白分泌和表达情况，检测细胞的迁移、增殖能力。 实验二:雄性Sprague-Dawley大鼠32只，随机均分为四组，每组8只:正常对照组（C组）、肺动脉高压组（MCT组）、脂肪间充质干细胞治疗组(ADSCs)、转染BMP2基因组（BMP2组）。MCT组、ADSCs和BMP2组组一次性腹腔注射MCT60mg/Kg，C组经腹腔注射相同体积的生理盐水，两周后ADMSC组经右颈外静脉一次性给予ADMSC5×106/1ml，C组和PAH组经左颈外静脉一次性给予1ml的生理盐水。于ADMSC移植后2W，右心导管法测定大鼠的肺动脉平均压(MPAP)、右心室肥厚指数[RVHI％=右心室游离壁(RV)重量/左心室+室间隔(LV+S)重量]、并运用ipp6.0图像分析软件分析肺组织切片，测定直径在100-200μm范围的肺小动脉管壁厚度(WT)占动脉外径(ED)的百分比(WT％)及管壁面积(WA)占血管总面积的百分比(WA％)。荧光显微镜观察带GFP标记的ADMSC在肺内的定植。Western blot和Real time-PCR检测肺组织BMP-2、BMPR2、Smad1、survivin和P21的mRNA与蛋白表达。 实验数据结果以均数±标准差表示，采用SPSS16.0进行统计分析，不同组间参数比较采用t检验或单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。 结果： 实验一:大鼠腹股沟脂肪组织经过胶原酶消化后，72小时细胞贴壁，成纤维细胞样生长，原代细胞分离种植后7-10天融合至90％左右可以传代，传代后细胞生长旺盛，约2-3天即可再次传代。流式细胞仪测定细胞表面免疫表型，CD29，CD90，CD105阳性，CD14，CD45基本阴性。油红染色鉴定成脂诱导14天后的细胞可见细胞浆内脂滴染成红色，茜素红染色鉴定成骨诱导14天的ADSCS，细胞变长，聚集，细胞浆可见棕红色的钙化沉积颗粒。慢病毒eGFP-BMP-2基因转染ADSCs后，倒置相差荧光显微镜下可见转染细胞表达绿色荧光，转BMP-2基因EPC的BMP-2蛋白分泌和表达明显增加(P＜0.05)。转染后细胞MTT及transwell活性检测发现转染细胞与空载及未转染组生长曲线及迁移能力，没有明显差异(P＞0.05)。 实验二:转BMP-2基因EPC移植后可定位于肺组织。与MCT组相比，ADSCs组和转基因ADSCs组可明显改善肺组织的病理学改变，治疗组大鼠的MPAP、RVHI％、WA％和WT％明显降低，转基因ADSCs组降低更为明显，转基因ADSCs组的肺组织可检测到BMP-2和BMPR2蛋白和mRNA表达明显增加(P＜0.01)，Smad1 mRNA表达明显增加(P＜0.01)，并且转基因ADSCs组与单纯ADSCs组比较可检测到更多的P21蛋白表达，及更少的survivin蛋白表达(P＜0.05)。 结论： 1、慢病毒eGFP-BMP-2基因转染ADSCs后，可增加ADSCs分泌和表达BMP-2蛋白，对其增殖活性和迁移能力无明显影响。 2、转BMP-2基因ADSCs移植后可定位于肺损伤部位，使肺组织的BMP-2蛋白和mRNA表达增加，进而发挥ADSCs与BMP-2的双重作用。可通过激活BMP通路减少肺动脉重构，减轻损伤后肺动脉平滑肌的病理学改变，治疗肺动脉高压。 3、激活的BMP通路通过减少survivin蛋白的表达，增加P21蛋白表达治疗肺血管重构。