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研究背景由于缺少明显的临床症状、发病隐匿，多数卵巢癌病人就诊时已属晚期。尽管给予减瘤术及基于铂类的术后化疗，患者的5年生存率仍然仅30%左右。因此，迫切需要寻找提高卵巢癌治疗效果的新治疗方法。侵袭转移是导致卵巢癌患者死亡的主要原因。研究显示基质金属蛋白酶2（MMP-2）在卵巢癌的侵袭和转移过程中起着重要作用，它降解基底膜，导致肿瘤细胞转移，并且释放包括血管内皮生长因子（VEGF）在内的多种促肿瘤血管形成因子。MMP-2和VEGF与卵巢癌的转移和不良预后有关。近些年来，研究显示MMP-2的沉默可抑制多种肿瘤的转移和血管形成，VEGF抑制剂贝伐单抗也被批准用于晚期卵巢癌的治疗，但是利用功能强大的RNA干扰技术抑制MMP-2基因在卵巢癌转移和血管形成中的作用还缺少研究，本课题将对此进行相关的研究。研究目的利用RNA干扰技术沉默人卵巢癌细胞株OVCAR-3中MMP-2基因，观察其生长、粘附、侵袭及迁移能力的变化，并检测卵巢癌细胞诱导的体外血管形成能力变化，以探讨MMP-2基因对卵巢癌细胞转移和血管形成的影响。研究方法1.人卵巢癌细胞株OVCAR-3和人脐静脉内皮细胞HUVECs的培养：含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的高糖型DMEM培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。2. siRNA的设计、合成：设计、合成3对靶向MMP-2基因的小分子干扰RNA （siRNA）和1对阴性对照siRNA（siRNA-NC），以与siRNA等体积的DMEM转染作为空白对照组，利用Real-Time quantitative PCR技术检测转染后MMP-2mRNA的表达，获得MMP-2基因沉默效果最佳的siRNA，并用于用于后续试验；3.用沉默效率最佳siRNA转染OVCAR-3细胞，通过Real-Time quantitativePCR、Western Blot技术检测细胞中不同时间MMP-2和VEGF的mRNA及蛋白表达。4.利用MTT实验绘制细胞生长曲线，检测MMP-2基因沉默后OVCAR-3细胞生长情况。5.利用体外粘附实验检测MMP-2基因沉默后OVCAR-3细胞60min时及90min时的粘附能力，并计算黏附抑制率。6.利用Transwell小室细胞侵袭实验检测MMP-2基因沉默后OVCAR-3细胞侵袭能力的变化。7.利用划痕实验检测MMP-2基因沉默后OVCAR-3细胞迁移能力。8.利用体外血管形成实验检测OVCAR-3细胞诱导的体外血管形成能力，观察所形成的管状结构，计算每视野管型分支数量及其长度。9.统计分析：采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料的结果以±s表示，组间比较采用one way ANOVA分析，P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.转染后MMP-2基因表达受到抑制，并且不同序列抑制作用不同，沉默效率最高者达77.8%，并用此序列进行后续试验。2.与阴性对照组相比，转染后24h、48h和72h实验组的MMP-2mRNA水平分别下降73.8%、78.8%和78.4%，各实验组与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P <0.01），实验组之间比较仅48h和72h组差异无统计学意义（P=0.654）。与阴性对照组比较，转染后48h实验组VEGF mRNA水平下降75.5%，差异有统计学意义（P <0.01）。3.与阴性对照组比较，转染后24h、48h和72h各实验组MMP-2蛋白表达水平分别下降72.6%、81.2%和76.4%，各实验组与阴性对照组比较以及实验组之间比较差异均有统计学意义（P <0.01）。与阴性对照组比较，转染后48h实验组VEGF蛋白水平下降78.3%，差异有统计学意义（P <0.01）。4. MTT试验结果提示RNA干扰MMP-2基因对OVCAR-3细胞生长无明显影响。5.细胞体外黏附试验结果显示，与阴性对照组比较，培养60min时和90min时试验组OVCAR-3细胞的粘附能力均明显下降，粘附抑制率分别为42.1%和50.4%。各自与其阴性对照组比较差异均有统计学意义（P <0.01）。6.细胞体外侵袭试验结果显示，与阴性对照组（141.2±22.7）和空白对照组（140.1±24.1）相比，实验组（99.2±8.3）平均穿过滤膜细胞数明显减少（P <0.01）。7.体外划痕实验结果提示RNAi干扰MMP-2基因后OVCAR-3细胞迁移能力明显降低。划痕后12小时，实验组迁移距离为120±14μm,明显低于阴性对照组（187±23μm）和空白对照组（186±17μm），差异有统计学意义（P <0.01）。8.体外血管形成实验结果显示，RNAi干扰OVCAR-3细胞MMP-2基因后，所获得条件培养基诱导的血管形成能力明显下降。与阴性对照组比较，实验组管状结构的总长度和分支数分别减少52.9%和47.5%。各自与其阴性对照组比较差异均有统计学意义（P <0.01）。结论：1.靶向MMP-2的RNA干扰可沉默卵巢癌OVCAR-3细胞MMP-2mRNA及其蛋白的表达，并抑制卵巢癌细胞的粘附、侵袭和迁移能力，而不影响其生长能力。2.靶向MMP-2的RNA干扰能够抑制卵巢癌细胞诱导的体外血管形成能力，并且MMP-2转录水平的抑制可降低卵巢癌细胞的VEGF水平。提示MMP-2可能调节卵巢癌中VEGF的表达，从而调节卵巢癌的血管形成。