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目的:不孕症是严重危害人类生殖健康疾病,在全球范围内影响10%-15%的夫妇,其中,男性原因约占一半因素。精子发生障碍在男性不育因素约占15%。精子发生包括精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减速分裂、精子细胞的变形等阶段,受到睾丸微环境的精细调控。任何阶段调控异常均有可能导致精子发生障碍,进而导致男性不育。如何使每一对有生育要求的夫妇有自己遗传学的后代是一个尚未解决的关键科学问题。支持细胞是生精小管内唯一的重要体细胞,对精子发生有重要的调控作用。支持细胞与Leydig细胞、周围血管、细胞因子等共同构成了精子发生的微环境。支持细胞能分泌多种调控精原干细胞自我增殖和分化的生长因子,如GDNF、SCF等。支持细胞是构成血睾屏障的主要组成成分,后者为生精过程提供了稳定的内环境。据最近研究报道,通过重编程可使支持细胞转变成为多能神经干细胞,表明支持细胞在再生医学中有广泛的应用前景。支持细胞数量及质量的异常均可导致精子发生障碍。BMP6作为TGF-β家族的重要成员之一,能够促进多种干细胞的自我增殖与分化,主要表现在:1)促进生殖干细胞增殖,抑制其分化;2)促进间充质干细胞及造血干细胞的增殖;3)通过时间依赖性方式对神经干细胞具有重要的调控作用;4)BMP6表达异常还与恶性肿瘤、骨骼畸形、遗传与代谢紊乱和心血管疾病发生有重要的相关性。但是,BMP6对支持细胞的表达、功能及机制研究尚未报道。因此,本研究的主要研究目的有:1)确定BMP6及其多种受体在人类支持细胞的表达;2)探讨BMP6对人类支持细胞的增殖与凋亡的生物学功能;3)揭示BMP6调控人类支持细胞作用的信号转导机制。方法:首先,我们将临床获得的梗阻性无精子症(Obstructive Azoospermia,OA,由炎症引起,有正常的精子发生)患者睾丸组织进行两步酶消化和差速贴壁分离与纯化人支持细胞。采用台盼蓝染色检测获得细胞的活性;利用免疫细胞化学方法鉴定获得细胞的身份及纯度。进一步,我们利用RT-PCR,免疫细胞化学(Immunocytochemistry)及蛋白免疫印迹(Western Blots)方法鉴定支持细胞是否表达BMP6及其受体ACVR1、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2等。利用免疫组织化学(Immunohistochemistry)鉴定BMP6及其受体在人类睾丸组织中表达位置。我们在体外培养的支持细胞中加入外源性BMP6生长因子,通过细胞增殖实验(CCK-8)、EDU摄入实验、酶联免疫吸附测定法(ELISA)实验、Annexin-V/PI流式细胞术等方法检测外源性BMP6对人支持细胞生长情况的影响。另一方面,我们利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术处理培养的人支持细胞,探讨内源性BMP6敲低对支持细胞生长情况的作用。同时,利用Western blots方法检测沉默BMP6后对支持细胞的多种蛋白,包括ZO1、OCLN、SCF、GDNF、AR和AMH的影响。采用RNAi技术特异性沉默BMP6后,分析BMP6对多种信号通路蛋白,包括phos-ERK1/2/ERK2、phos-AKT/AKT、phos-Smad2/3/Smad2/3、phos-Smad1/5/8/Smad1/5/8,及其对多种细胞周期蛋白cyclin A、cyclin B1、cyclin D1、CDK2和cyclin E的变化,揭示BMP6对人类支持细胞的作用机制。我们采用RNAi技术检测BMP6调控的相关转录因子,以进一步研究其分子机制。最后,我们利用RNAi技术,特异性敲低转录因子DACH1和TFAP2A,通过CCK-8增殖实验观察人支持细胞增殖情况,探讨这些转录因子的作用。并利用RT-PCR和Western Blots比较BMP6基因与蛋白在OA及非梗阻性无精子症(NOA)患者支持细胞的差异表达情况。结果:台盼蓝染色检测分离的人支持细胞活性>98%。免疫细胞化学显示分离的细胞表达人类支持细胞的多种标记物,包括WT1、SOX9、GDNF、SCF、ZO1、OCLN、BMP4,其纯度可达96%。RT-PCR及Western Blots实验进一步验证分离的细胞为人类支持细胞。RT-PCR、免疫细胞化学及Western Blot表明,人支持细胞表达BMP6及其多种受体,包括ACVR1、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2等。免疫组织化学技术进一步显示,BMP6表达于人支持细胞,而不表达于生殖细胞,其受体除了表达于支持细胞,同时达于部分生殖细胞(精原细胞和精母细胞)。在体外培养的人支持细胞中加入BMP6生长因子,CCK-8实验与EDU摄入实验可见,外源性BMP6促进人支持细胞的增殖,同时Annexin-V/PI实验显示,BMP6抑制支持细胞凋亡。另一方面,CCK-8与EDU摄入实验表明,沉默内源性BMP6可抑制支持细胞的增殖,同时Annexin-V/PI流式细胞术表明,沉默BMP6促进支持细胞的凋亡。在体外培养的人类支持细胞加入BMP6生长因子,ELISA实验发现,支持细胞分泌SCF因子水平升高,而特异性沉默BMP6后,其分泌SCF因子水平降低。特异性地沉默人支持BMP6后,Western Blots显示,ZO1、SCF、GDNF和AR等蛋白表达降低,而OCLN和AMH等蛋白的表达水平未见明显异常。在培养的支持细胞中加入BMP6生长因子后,phos-Smad2/3与周期蛋白cyclin D1表达水平升高,而沉默BMP6后,phos-Smad2/3和周期蛋白cyclin D1表达水平下降。BMP6处理支持细胞15分钟后,定量PCR发现支持细胞转录因子DACH1和TFAP2A转录升高;特异性敲低BMP6后,转录因子DACH1和TFAP2A转录下降。最后,我们分别特异性沉默DACH1和TFAP2A后,人支持细胞增殖降低,表明BMP6通过激活转录因子DACH1和TFAP2A调控支持细胞的生长情况。RT-PCR和Western blots显示,BMP6基因与蛋白在OA患者支持细胞表达水平显著高于生精能力低下、生精阻滞和唯支持细胞综合征患者。结论:人支持细胞表达BMP6及其多种受体,BMP6通过自分泌作用方式作用于人支持细胞,而通过旁分泌方式作用于人类生殖细胞。BMP6促进人支持细胞的增殖与DNA合成,同时抑制其凋亡。BMP6刺激人类支持细胞的ZO1、SCF、GDNF和AR等蛋白的分泌。总之,BMP6通过激活Smad2/3和cyclin D1通路和DACH1/TFAP2A转录因子促进人支持细胞的增殖与DNA合成并抑制其凋亡。BMP6通过作用于人类支持细胞影响人类精子发生,这将为阐明人类支持细胞的分子调控机制和男性不育的病因学机制提供理论依据。