论文部分内容阅读
目的：1.构建双特异性双链抗体BsDb（抗-PSMA×抗-FITC）的基因序列及质粒载体pET-28(a)-BsDb，将其转入大肠杆菌中构成BsDb的原核表达体系，以IPTG诱导表达并纯化。2.培养人前列腺癌细胞系，检测PSMA表达情况及鉴定双特异性抗体BsDb的活性。方法：1.通过对本课题组先期测得的抗-PSMA单链抗体（ScFv-P）与抗-FITC单链抗体（ScFv-F）基因序列的分析，获得两条ScFv各自的重链和轻链序列。通过VectorNTI9软件将ScFv-P的重链（PVH）和轻链（PVL）与ScFv-F的轻重链（FVL和FVH）交叉连接，构成PVH-Linker-FVL和PVL-Linker-FVH两条杂合链，将其连接后以全基因合成的方法合成BsDb的基因片段。在其C端设计一个XbaⅠ酶切位点，N端设计一个XhoⅠ酶切位点。将BsDb基因片段用XbaⅠ与XhoⅠ两个限制性内切酶进行双酶切并与经过同样双酶切的pET-28(a)质粒载体用T4连接酶连接成pET-28(a)-BsDb，将其转入大肠杆菌BL21，以IPTG诱导其表达，对表达产物用镍亲和层析柱进行纯化。2.培养人前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3和人胰腺癌细胞系PANC-1，利用Westernblot检测PSMA在体外培养的前列腺癌细胞系中的表达。3.通过免疫细胞化学、Western blot等检测BsDb与PSMA结合的特异性，通过ELISA检测其与FITC结合的特异性。结果：1.成功构建BsDb基因序列，且将其成功导入pET-28(a)质粒中形成pET-28(a)-BsDb，将该质粒导入大肠杆菌BL21实现原核表达。通过对诱导剂IPTG浓度与温度、摇床转数、诱导时间等条件的选择，最终摸索出实现BsDb可溶性表达的条件，即IPTG浓度选择0.50‰，诱导温度、摇床转数和诱导时间分别为16℃，150rpm/min，12h。纯化时目的蛋白通过镍亲和层析柱，其His标签与镍亲和层析柱结合，但同时亦有杂蛋白与镍亲和层析柱非特异性结合，选择不同浓度梯度的咪唑液洗涤，低浓度的咪唑可以将非特异性结合的蛋白洗脱，而高浓度的咪唑才能将与镍亲和层析柱特异结合的目的蛋白洗脱，这时收集则为纯化的BsDb，最终的咪唑浓度梯度为平衡液选10mmol/L，然后分别用40、120、500mmol/L浓度咪唑洗脱，500mmol/L的咪唑洗脱的为目的蛋白。纯化后的BsDb通过BCA蛋白定量法测得其浓度为181μg/ml。2.人前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3以及人胰腺癌细胞系PANC-1均为单层贴壁生长；Western blot证实PSMA在LNCaP细胞中高表达，而在其余两种细胞系中不表达。3.通过免疫细胞化学和Western blot检测发现BsDb与PSMA有良好的结合特性，通过ELISA检测发现其与FITC能特异性结合。结论：1.前列腺癌LNCaP细胞系高表达PSMA。2.通过基因工程技术制备的双特异性双链抗体BsDb（抗-PSMA×抗-FITC）能在原核表达体系实现可溶性表达并被纯化；其具有两个特异性结合靶点：特异性结合PSMA的靶点和特异性结合FITC的靶点。为下一步体内试验奠定了坚实的基础。