论文部分内容阅读
背景大肠癌(colorectal cancer,CRC)包括结肠癌和直肠癌,是最常见的消化道恶性肿瘤之一,全世界每年约有120万新发病例,约60万人死于该疾病。中国医学科学院肿瘤医院/国家癌症中心在CA Cancer J Clin(临床肿瘤)杂志发表的2015年中国癌症统计数据显示我国大肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居前5位,其中新发病例37.6万,死亡病例19.1万,已成为严重危害中国人民健康的疾病。随着我国经济的发展,人民生活水平的不断提高及饮食结构的改变,进食过多脂肪、肉类,而少膳食纤维,体育锻炼较少,精神压力过大,导致大肠癌的发病率、病死率逐年上升,同时基因的改变也导致了个体对大肠肿瘤的易感性。肿瘤的发生发展是一个复杂的病理、生理过程,涉及到多种基因改变的复杂的异质性疾病。通常,基因组在复制、转录、翻译等各个水平的改变均会影响其生物学行为的改变。因此对大肠癌相关分子机制的深入研究,将对大肠癌的预防和治疗具有十分重要的意义。我们前期的研究发现,SLC5A8基因在大肠癌组织中表达下降或缺失,提示该基因的沉默与大肠癌的发生存在一定关系。但是对SLC5A8基因在大肠癌中沉默的分子机制、作用底物、信号通路、与其他蛋白的相互作用等还不是很了解,仍需我们进一步的深入研究。溶质载体家族第5家族第8员(solute carrier family 5 member 8,SLC5A8)是2002年Rodriguez等人发现的新的候选抑癌基因,位于人类染色体12q13,属于Na+/葡萄糖共转运蛋白家族成员,是短链脂肪酸(SCFA)如,醋酸、丙酸、丁酸、丙酮酸和乳酸的Na+-偶联转运蛋白。国内外学者发现SLC5A8在人类的食管癌、贲门癌、乳腺癌、甲状腺癌、肺癌、胰腺癌、脑胶质瘤、前列腺癌、急性髓系白血病等多种肿瘤组织中表达降低或缺失,说明其可能参与了肿瘤的发生、转移、侵袭过程。研究发现,SLC5A8基因在肿瘤组织中表达降低或缺失的原因是其GPG岛的甲基化及组蛋白的去乙酰化。丁酸作为SLC5A8基因的转运底物之一,是由细菌发酵膳食纤维产生的。丁酸除了作为β-氧化和柠檬酸循环产生代谢能量的底物,同样也是组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC),尤其是HDAC1和HDAC3亚型。这些内源性HDAC抑制剂存在于正常结肠腔中,SLC5A8介导它们进入结肠上皮细胞,并抑制HDACs。由于SLC5A8基因的表达减少或缺失,使丁酸不能进入结肠腔中,这可能成为大肠癌发生的原因之一。目的探讨SLC5A8基因转染对大肠癌细胞株SW480增殖和侵袭力的影响。方法实验分三组,实验组:将含SLC5A8基因的p EX-4质粒转染到大肠癌细胞株SW480;空载对照组:将空载质粒p EX-4转染到大肠癌细胞株SW480;空白对照组:正常大肠癌细胞株SW480。(1)运用q RT-PCR法对细胞中SLC5A8 m RNA表达水平进行分析;(2)采用MTS法检测细胞增值抑制率;(3)Transwell细胞侵袭实验检测SLC5A8基因转染SW480细胞后侵袭力的变化;(4)通过细胞划痕实验观察转染SLC5A8基因对SW480细胞迁移能力的影响。统计方法:所有数据应用SPSS19.0统计软件分析;计量数据采用均数±标准差(sx±)表示;组间比较采用t检验和ANOVA方差分析,检验水准P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)荧光显微镜显示:转染p EX-4-SLC5A8、p EX-4空载质粒的SW480细胞均显示高强度的绿色荧光。SLC5A8扩增产物溶解曲线呈现单峰,引物特异性良好,扩增产物及扩增循环数(CT值)均可用。q RT-PCR结果显示,转染后细胞中SLC5A8 m RNA表达水平显著增高,表明转染效率较高,实验方法及条件可靠。(2)SLC5A8基因转染后,通过MTS法检测发现,当培养基中加入丁酸时,实验组细胞SW480的增殖抑制率高于对照组,差异具有统计学意义(P=0.013)。当培养基中没有丁酸,实验组细胞SW480的增殖抑制率与对照组之间差异无统计学意义(P=0.957)。实验组在培养基中有丁酸时对细胞SW480的增殖抑制率高于培养基中无丁酸,差异具有统计学意义(P=0.017)。无论培养基中有、无丁酸,对照组对细胞SW480的增值抑制率差异不具有统计学意义(P=0.930)。MTS实验结果说明实验组SW480细胞在有丁酸时增殖明显受到抑制。(3)Transwell体外侵袭实验结果显示,实验组的透膜细胞数低于空载对照组,差异有统计学意义(t=14.072,P=0.000)。实验组的透膜细胞数低于空白对照组,差异有统计学意义(t=17.710,P=0.000)。空载对照组透膜细胞数与空白对照组之间的差异无统计学意义(t=1.540,P=0.162)。Transwell体外侵袭实验以透膜细胞数作为侵袭力的评价指标。说明SLC5A8基因在丁酸的作用下可以抑制大肠癌细胞株SW480的侵袭能力。(4)应用细胞划痕实验观察SLC5A8基因对细胞迁移的影响,划痕后24小时,实验组细胞迁移率低于空载对照组,差异有统计学意义(t=13.617,P=0.000)。实验组细胞迁移率低于空白对照组,差异有统计学意义(t=15.997,P=0.000)。空载对照组细胞迁移率与空白对照组之间的差异无统计学意义(t=1.421,P=0.193)。同样,划痕后48小时,实验组细胞迁移率低于空载对照组,差异有统计学意义(t=29.526,P=0.000)。实验组细胞迁移率低于空白对照组,差异有统计学意义(t=48.936,P=0.000)。空载对照组细胞迁移率与空白对照组之间的差异无统计学意义(t=1.988,P=0.082)。说明SLC5A8基因在丁酸的作用下可以抑制大肠癌细胞株SW480的迁徙能力。结论1.SLC5A8基因在大肠癌细胞株SW480中表达下降或缺失。2.本实验所采用基因转染技术成功将SLC5A8基因转染到大肠癌细胞株SW480中。3.SLC5A8基因抑制大肠癌细胞株SW480的增殖、侵袭及迁徙是通过丁酸介导的,丁酸是其转运底物之一。4.本实验为大肠癌的基因治疗提供新的方法。