亲和色谱又称为亲和层析,是一种利用与固定相高度特异结合（如抗原与抗体、酶与底物、受体与配基的结合等）的特性将特定组分从混合物中分离出来的色谱方法，常用于生化大分子的分离与纯化。亲和色谱法的出现大幅提高了蛋白质纯化的速度与效率，同时也为蛋白质潜在相互作用伙伴研究（如pull-down、共纯化）提供了技术平台。Pull-down技术的基本原理是用固相化的亲和配基捕获细胞裂解液中的带有纯化标签（该标签能与固相化配基特异结合）的融合蛋白，再以此为“诱饵”，钓取与之相互作用的蛋白。固相化的“诱饵”蛋白可以用来试探与多种来源的（可疑的或完全未知的）“猎物”蛋白的相互作用关系，从而判定“诱饵”和“猎物”两个蛋白质之间是否存在相互作用。　　 本研究采用改良的亲和色谱法成功分离纯化了AP-2α和TES这两类目的蛋白，并且利用GST融合蛋白亲和色谱技术(pull-down)分析了这两类蛋白之间的相互作用关系。　　 转录因子通过对细胞内外刺激作出反应来调节基因的表达，它们常常通过控制基因转录的基本机制在决定细胞的命运中起主要作用。AP-2α作为一类重要的转录因子AP-2家族的成员，具有组织表达特异性和DNA结合特异性。最近很多研究表明，AP-2α通过与其它蛋白的相互作用在胚胎发育，细胞分化，肿瘤发生等方面发挥重要作用，转录调控多个下游靶基因。在本室先前的实验中，以AP-2α为饵蛋白，用酵母双杂交系统筛选HeLa细胞cDNA文库得到的阳性克隆中发现了TES。人类TES基因在基因组中位于7q31.2,近来很多报道表明该基因可能是一个潜在的肿瘤抑制基因。TES基因编码一个含有421个氨基酸残基的蛋白质序列，其蛋白N端是一个PET domain，C端则是三个紧邻的LIM domain。为了研究TES C端各LIM domain的功能，确定AP-2α与之相互作用的具体位点，本文在含有TES基因全长编码序列的载体pCMV-HA-TES的基础上，用PCR扩增并克隆了TES C端含有的三个LIM domain编码序列。将得到的片段亚克隆入原核表达载体pQE-N1，构建了表达质粒pQE-N1-LIM 1、pQE-N1-LIM 2和pQE-N1-LIM 3。在大肠杆菌E.coli BL21中表达His融合蛋白并用基于Ni2+的固定金属离子亲和色谱对表达产物进行了纯化。　　 用同样的方法构建编码AP-2α各蛋白片段的表达质粒并转入大肠杆菌E.coli BL21，表达产物为与谷胱甘肽-S-转移酶融合的融合蛋白。菌体经超声破碎后,上清液用谷胱苷肽琼脂糖4B凝胶珠亲和色谱法纯化，产物纯度在90％以上。　　 然后用自制的抗-His-TES抗体，通过GST Pull-down技术分析了TES C端的三个LIM domain与AP-2α各片段之间的相互作用。实验结果表明，AP-2α蛋白与TES蛋白之间存在相互作用，是由于AP-2αC端能与TES C端的第一个LIM domain结合；同时根据AP-2α蛋白只能与TES C端而不能与TES全长蛋白结合的实验事实提出了TES蛋白存在自身相互作用的可能，导致TES蛋白至少存在开放（open）和封闭（close）两种折叠构像。即位于TES蛋白C端的LIM domain可与TES蛋白自身N端的PET domain发生直接相互作用，封闭了位于TES LIM domain 1上的AP-2α结合位点，使TES蛋白处于封闭的构像，而不能与AP-2α发生相互作用。