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研究背景急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是高发病率和高病死率的临床常见呼吸危重症。如流行病学资料所示,ALI的发病率约为64.278.9人/每10万人,病死率约为38.5%,55%的ALI患者可在72小时内进展为病情较严重阶段,即ARDS[1-3]。ALI/ARDS的高病死率源于其发病机制错综复杂、尚未完全阐明,目前缺乏特效治疗。ALI/ARDS的病理基础是失衡的炎症反应,致使肺泡-肺血管壁屏障受损,引起充血性水肿,引发顽固性低氧血症[4,5]。而失控的炎症反应和继发的过度氧化应激是造成ALI/ARDS患者肺泡上皮细胞损伤的重要机制之一,因而将炎症反应及氧化应激调控在合理水平是对ALI/ARDS患者实施肺保护策略的关键。TNF-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是全身炎性反应中释放最早、最关键的细胞因子之一,主导炎症“瀑布式级联反应”,导致促炎因子过度活化、抗炎因子释放减少,炎症反应失衡[6]。以TNF-α为代表的炎症因子大量释放是启动急性肺损伤病理进程的重要机制。课题组前期研究中,以肿瘤坏死因子-α预处理肺泡II型上皮细胞(A549细胞株),观察到细胞上清液中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等炎症因子浓度明显上调,抗炎与促炎反应放大;活性氧生成增多,脂质氧化程度增强,而抗氧化物质过度消耗,氧化应激失衡;同时存在NF-κB通路的活化,最终导致A549细胞凋亡水平上调[7]。上述实验模拟了急性肺损伤进程中失控的炎症反应、失衡的氧化应激及结构细胞凋亡等特点,成功构建ALI体外细胞模型。当机体处于过度氧化应激状态时,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)大量积蓄,超出机体的清除能力,导致氧化还原反应失衡,干扰生物大分子的生理功能,进而参与急性肺损伤、动脉粥样硬化等疾病的病理过程[8]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase,NOX)家族是ROS的重要来源,包括:NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5以及DUOX1、DUOX2。各亚型的结构、表达情况和功能具有组织和细胞差异性。其中NOX1被证实在肺泡上皮细胞中有明确表达,该亚型可能是ALI过程中诱导产生大量ROS,介导细胞氧化损伤的重要参与者[7,9]。将NOX1作为靶基因,调控其生成ROS,理论上可减轻细胞氧化损伤,降低细胞凋亡率。核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)是目前发现的最重要的抗氧化应激转录因子之一,在急性肺损伤中发挥关键作用[10,11]。Nrf2主要受胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein1,Keap1)负性调控,受到亲电子试剂刺激时,迅速活化发生核转位,并与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合,从而介导表达抗氧化物质,对抗ROS引发的氧化应激[11]。其主要通过调控II相解毒酶和抗氧化酶等发挥细胞保护作用,而对氧化相关基因NOX家族的调控作用尚未明确。目前急性肺损伤相关基础与临床研究多集中于炎症反应领域,氧化应激相关研究资料尚不够丰富。Nrf2是急性肺损伤过程中作用广泛的调节因子之一,参与多种基因的转录调控。本课题组前期研究发现Nrf2与NOX1在TNF-α诱导的A549细胞损伤中表达同时上调,且通过生物软件预测到NOX1启动子上游存在Nrf2结合序列。由此,我们假设:TNF-α诱导的肺泡II型上皮细胞氧化损伤中,Nrf2作为NOX1的一个重要转录因子,识别并结合NOX1启动子区结合位点从而发挥调控作用。目的1.探讨Nrf2基因水平改变对TNF-α刺激的肺泡II型上皮细胞(A549细胞株)炎症反应水平和氧化应激程度的影响;2.探讨Nrf2对TNF-α诱导的肺泡II型上皮细胞NOX1基因的可能调控机制。方法1.TNF-α诱导肺泡II型上皮细胞NOX1、Nrf2基因表达水平改变A549于含10%FBS的RPMI-1640培养基中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。以不同浓度TNF-α(0/2.5/5/10/20/40ng.ml-1),干预A549不同时长(0/6/12/24/36/48h)后,采用Real-time PCR、Western Blotting检测Nrf2、NOX1基因及蛋白表达,明确TNF-α能否影响其表达,确定TNF-α的最佳干预浓度和时长。2.Nrf2对TNF-α诱导的肺泡II型上皮细胞炎症反应及氧化应激损伤的保护作用实验分组:A.Control组、B.TNF-α组、C.Nrf2 si RNA组、D.阴性对照si RNA组、E.Nrf2高表达载体组、F.空载体组。TNF-α刺激前,预先转染siRNA或载体6h,弃转染液后以TNF-α继续干预24h。采用ELISA法评估细胞上清液中IL-6和IL-8水平,Real-time PCR、Western Blotting法测定NF-κB表达水平,DCFH-DA探针法检测ROS水平,比色法检测丙二醛(MDA)浓度和总抗氧化能力。3.Nrf2对TNF-α诱导的肺泡II型上皮细胞NOX1基因表达的影响实验分组同上。采用Real-time PCR、Western Blotting法测定NOX1m RNA及蛋白表达。Alibaba 2.1软件预测NOX1近端启动子区Nrf2的可能结合元件,以此为基础,分别构建含NOX1近端启动子上游1500bp片段的重组质粒“p GL3-NOX1-1500”、缺失Nrf2结合位点序列的启动子片段所对应的重组质粒“p GL3-NOX1-1489”。将上述重组质粒及p GL3空质粒分别转染入A549,并转染p RL–TK作为内对照,以TNF-α刺激24h后,测定质粒荧光素酶活性。4.统计学分析所获数据运用SPSS 21.0软件包分析,以“均数±标准差”表示,两组间比较行独立样本t检验,多组间比较行单因素方差分析,显著性水准α取0.05,双侧。结果1.TNF-α诱导肺泡II型上皮细胞NOX1和Nrf2基因表达水平改变1.1 A549细胞经不同浓度TNF-α刺激24h,实验组NOX1和Nrf2 m RNA水平,均较Control组上调,以10ng/ml为著,P<0.05。经10ng/ml TNF-α刺激不同时长,实验组NOX1和Nrf2 m RNA水平均较Control组上调,以刺激24h为著,P<0.05。1.2经10ng/ml TNF-α刺激24h,A549细胞NOX1和Nrf2蛋白水平均较Control组上调,P<0.05。2.Nrf2对TNF-α介导的肺泡II型上皮细胞炎症反应及氧化应激损伤的保护作用2.1相较TNF-α组和阴性对照siRNA组,Nrf2 siRNA组NF-κB mRNA和蛋白表达水平上调,P<0.05;相较TNF-α组和空载体组,Nrf2高表达载体组NF-κB m RNA和蛋白水平下调,P<0.05。2.2相较TNF-α组和阴性对照si RNA组,Nrf2 si RNA组IL-6和IL-8水平上升,P<0.05;相较TNF-α组和空载体组,Nrf2高表达载体组IL-6和IL-8水平下调,P<0.05。2.3相较TNF-α组和阴性对照si RNA组,Nrf2 si RNA组ROS和MDA水平上调,P<0.05;相较TNF-α组和空载体组,Nrf2高表达载体组ROS和MDA水平下调,P<0.05。2.4相较TNF-α组和阴性对照si RNA组,Nrf2 si RNA组细胞总抗氧化能力上调,P<0.05;相较TNF-α组和空载体组,Nrf2高表达载体组总抗氧化能力上调,P<0.05。3.Nrf2对TNF-α诱导的肺泡II型上皮细胞NOX1基因表达的影响3.1 Nrf2 si RNA组NOX1 m RNA和蛋白水平,较TNF-α组和阴性对照si RNA组上调,P<0.05;Nrf2高表达载体组NOX1 m RNA和蛋白水平,较TNF-α组和空载体组下调,P<0.05。3.2经生物信息学软件分析,结果提示NOX1启动子区上游1500bp范围内可预测到1个Nrf2结合元件,位于-1199-1189,序列为5’-attacacagca-3’。3.3重组质粒“p GL3-NOX1-1500”和“p GL3-NOX1-1489”经琼脂糖电泳和测序鉴定,结构正确。3.4质粒“p GL3-NOX1-1500”和“p GL3-NOX1-1489”预转染A549细胞后,荧光酶素活性均较转染“p GL3”组高,P<0.05;而转染“p GL3-NOX1-1500”较转染“p GL3-NOX1-1489”,荧光酶素活性升高,P<0.05。结论1.TNF-α能够有效诱导肺泡II型上皮细胞NOX1、Nrf2 m RNA及蛋白表达水平改变。2.预转染Nrf2高表达载体可降低TNF-α诱导的肺泡II型上皮细胞炎症水平和氧化应激程度,对细胞起一定保护作用。3.不同表达水平Nrf2影响NOX1基因表达,Nrf2可能通过识别并结合NOX1启动子区结合元件从而对其进行转录调控。