脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是临床上的常见病和多发病,并以较高的致残率和病死率严重地影响着人们的健康。脑出血最重要的病理表现是血肿对周围组织的挤压,以及所释放的成分对周围细胞的毒性损伤,包括血液中的谷氨酸对神经元的直接刺激,脑出血也常能引起癫痫发作,并有一些可在脑出血2周后发生。脑内星形胶质细胞占胶质细胞总量的50%~60%,数量在神经元的5倍以上,在脑的发育和正常功能的维持中有重要作用。星形胶质细胞的谷氨酸转运可及时清除神经突触传递中释放的谷氨酸,对神经活动的可持续性与防止癫痫和兴奋性神经损伤起到关键作用。本实验针对脑出血对星形胶质细胞谷氨酸转运方面的影响进行了研究。目的在以往的研究中,对脑出血损伤的研究较多关注于神经元,而对神经胶质细胞的影响研究较少。考虑到脑出血后癫痫的高发作率,而星形胶质细胞的谷氨酸转运对癫痫的发生可有重要的影响,本研究重点考察血液成份是否可对星形胶质细胞的谷氨酸转运功能造成影响。本课题的初期研究起源于使用牛血清白蛋白(BSA,Bovine serum albumin)所看到的一些现象,在后续研究中对可能与血清白蛋白相关的一些血清成份进行了扩展分析与研究,以求比较全面地探索脑出血对神经胶质细胞的影响。方法星形胶质细胞培养、高效液相色谱、细胞器分离、Western blot和免疫荧光显微技术。以高效液相色谱法检测BSA的浓度及作用时间对星形胶质细胞胞外谷氨酸浓度的影响,结合使用Western blot以及细胞器分离技术研究星形胶质细胞经BSA作用后相关转运蛋白表达量及表达位置的变化;同时比较了不同制备方法与来源的BSA所产生效果,以及不同物种的血清对星形胶质细胞谷氨酸转运的影响。结果与空白对照组相比,BSA(Fisher公司)能够提高星形胶质细胞胞外谷氨酸的浓度,尤其是对于胰酶消化后尚未贴壁的细胞。谷氨酸转运体抑制剂TBOA可引起胞外谷氨酸浓度的持续升高,提示星形胶质细胞的胞外谷氨酸处于持续的摄取和释放之间的动态平衡。在TBOA完全阻断谷氨酸摄取时,BSA刺激可促进胞外谷氨酸的上升,表明BSA的作用主要是促进谷氨酸的释放。BSA对胞外谷氨酸浓度的提升作用与浓度和孵育时间相关。当BSA的作用浓度在0~1%范围内,星形胶质细胞胞外谷氨酸的浓度随着BSA浓度的增加而增高,BSA效果在浓度超过1%后接近于饱和。Western blot实验结果说明BSA作用后的星形胶质细胞的胱氨酸-谷氨酸交换蛋白(xCT)的全细胞表达量并无明显差异,但细胞器分离后xCT在细胞膜上的表达量显著升高,提示BSA可促进胞浆内xCT向细胞质膜的转移。BSA作为血液中功能广泛的载体,可吸附许多小分子物质乃至多肽等,不能排除商用BSA中混有其他血液成份。我们首先对比了不同公司的BSA,发现Fisher公司的BSA提升胞外谷氨酸浓度的效果远高于Sigma的BSA,提示早先看到的BSA的作用极可能来自于BSA携带的其它血清成份。我们在后续实验中使用了全血清,都以10%体积添加到DMEM中用于培养星形胶质细胞,结果表明不同物种的血清,不同年龄段的血清对胞外谷氨酸的浓度有显著不同,但都能使胞外的谷氨酸平衡浓度维持在数倍高于胎牛血清所达到的的平衡浓度。需要特别指出的是,在1μM附近,绝大多数谷氨酸受体开始对谷氨酸有明显反应。胞外的平衡谷氨酸浓度一旦达到几个μM甚至更高,将深远影响谷氨酸能各类受体的激活,诱发癫痫发作与神经损伤。我们目前尚不能精确指出血清中的何种成份在起作用,对此有待进一步的实验研究。结论牛血清白蛋白作用后星形胶质细胞胞外谷氨酸的平衡点有显著变化,这一现象与胱氨酸-谷氨酸交换蛋白的胞内分布的变化有关。进一步的研究说明BSA效应的真正原因是BSA所吸附的某些血液物质。脑出血局部病灶中血液成份直接作用于星形胶质细胞,可引起其胞外谷氨酸平衡点的升高,从而引起了受影响区域内谷氨酸受体的激活,进而引发癫痫等脑出血的后遗症。