胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。近几十年来,胃癌总体发生率有所下降,但胃癌的发生部位出现了明显的变化,主要表现在来源于胃远端部位（胃窦）胃癌的发生率明显下降,而食管胃交界部位（esophagogastric junction, EGJ）远端食管腺癌和贲门腺癌的发生率呈明显增高趋势,此变化趋势在西方国家尤为明显。初步研究结果表明,我国居民胃癌的发生部位也出现类似的变化,从上世纪90年代后我国北方太行山区居民贲门腺癌（gastric cardiac adenocarcinoma, GCA）的发病率呈现逐渐增高的趋势,具体机制尚不清楚。最近有研究提示,贲门腺癌在肿瘤的发生机制和生物学行为方面可能不同于非贲门部位的胃癌,为一种独特的胃癌病理学亚型。Maeda等发现贲门腺癌淋巴结转移率比远端胃腺癌（gastric distal adenocarcinoma, GDA）高,且预后不良。从病因学角度Hp感染是远端胃腺癌发生的重要危险因素,而在贲门腺癌发生中的作用却存在很大争议。因此,探讨不同部位胃癌在生物学行为、免疫表型和一些关键分子作用机制方面的可能差异,对进一步揭示胃癌发生部位变化的可能机制以及胃癌高发区居民胃癌的合理防治具有非常重要的意义,是肿瘤工作者面临的一个重要挑战。细胞周期调控异常是恶性肿瘤形成的一个重要机制。P16^INK4a和p14^ARF为INK4a/ARF家族成员,二者作为细胞周期调控蛋白,作用于细胞中两条最主要细胞周期调控通路Rb通路(p16^INK4a-Rb)和p53(p14^ARF-p53)通路,在肿瘤的发生、发展过程中起着关键作用。p16^INK4a和p14^ARF表达失活可见于多种人类肿瘤中,比如:皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、淋巴瘤、结直肠癌等。胃肠道肿瘤中p16^INK4a和p14^ARF表达与肿瘤组织的分化程度、组织分型等密切相关。目前尚未见有关p16^INK4a和p14^ARF在贲门腺癌和远端胃腺癌中表达的对比研究。细胞角蛋白（Cytokeratins,CKs）和黏蛋白（Mucins,MUC）是确定胃肠道癌免疫表型特征常用的标志物。角蛋白是上皮细胞中的骨架蛋白之一,是上皮细胞的特征性标志物,由分子量不同的角蛋白组成一个庞大的家族,依据上皮细胞类型的不同角蛋白谱不同,可依此确定肿瘤的病理组织学类型和分化方向。黏蛋白是分布于上皮细胞表面高度糖化、高分子量的糖蛋白,有MUC1、MUC2等多种类型,其中MUC2为分泌型黏蛋白,主要表达于肠杯状细胞,为胃黏膜肠上皮化生表面标志物,与胃癌组织学类型密切相关。为探讨贲门腺癌和远端胃腺癌在发生发展中存在的可能差异,本研究中我们从四个方面对不同部位胃癌组织进行了对比研究。主要包括:1贲门腺癌与远端胃腺癌组织CKs和MUCs免疫表型的对比分析;2 p14^ARF和p16^INK4a蛋白在贲门腺癌和远端胃腺癌组织中的表达及意义;3 p14^ARF和p16^INK4a基因在上述不同部位胃癌组织中缺失情况的对比分析;4贲门腺癌与远端胃腺癌组织p14^ARF和p16^INK4a基因甲基化的对比研究。本文拟通过探讨不同部位胃癌之间存在的差异,揭示我国贲门腺癌发病率升高的原因,为贲门腺癌的防治提供理论依据。本研究论文分为四个部分:第一部分:贲门腺癌与远端胃腺癌CKs和MUCs免疫表型的对比分析目的:通过各种不同CKs和MUCs表达变化的对比分析,探讨贲门腺癌和远端胃腺癌在免疫表型方面的差异。方法:选取2006-2009年河北省磁县县医院、赞皇县医院以及河北医科大学第二医院手术切除胃癌组织标本共99例,其中贲门腺癌50例（肿瘤中心在Z线上1cm和下2cm以内）,远端胃腺癌49例。运用免疫组织化学方法研究各种不同CKs分子（CK7、CK14、CK19和CK20）和MUCs（MUC1、MUC2和MUC5AC）在贲门腺癌与远端胃腺癌中的表达情况,对比分析不同部位胃癌组织之间CKs、MUCs免疫表型差异性。结果:1.1 CKs和MUCs的表达在贲门腺癌与远端胃腺癌组织中的对比分析免疫组织化学检测结果表明,CK14、MUC2在贲门腺癌与远端胃腺癌中的阳性表达率明显不同。CK14在贲门腺癌组织中的阳性表达率明显高于远端胃腺癌组织（30.0% vs 10.2%, P<0.05）,而MUC2的阳性表达率在远端胃腺癌组织中显著高于贲门腺癌组织（71.4% vs 52.0%, P<0.05）。进一步分析发现,CK14的表达在贲门腺癌组织中与肿瘤组织分化程度以及有无淋巴结转移相关。中低分化贲门腺癌肿瘤组织CK14阳性表达率明显低于高分化肿瘤组织（22.0% vs 66.7%, P<0.05）;伴有淋巴结转移的组织CK14阳性表达率比无淋巴结转移者明显降低（17.9% vs 45.5%, P<0.05）。而在远端胃癌组织中CK14表达与组织分化程度和淋巴结转移均无相关性（P>0.05）。除CK14和MUC2外,其他相关分子包括:CK7、CK19、CK20、MUC1和MUC5AC的表达在贲门腺癌与远端胃腺癌中均未见显著差异（P>0.05）。1.2贲门腺癌和远端胃腺癌中CK7、CK20以及CK7/CK20联合表达特征的对比研究分别对CK7和CK20在不同部位胃癌中的表达进行比较,结果表明CK7和CK20在贲门腺癌组织以及远端胃腺癌组织中阳性表达率均无明显差异（CK7:86.0% vs 79.6%, P>0.05;CK20:56.0% vs 40.8%, P>0.05）。在远端胃腺癌组织中CK20的表达与组织分化程度相关。中低分化程度癌组织CK20阳性表达明显低于高分化腺癌（33.3% vs 70.0%, P<0.05）。而在贲门腺癌组织中,CK20表达与组织分化程度及有无淋巴结转移无明显相关（P>0.05）。CK7/CK20联合表达特征的分析表明,50例贲门腺癌中40.0%为CK7+/CK20-,46.0%为CK7+/CK20+,10.0%为CK7-/CK20+,仅4.0%为CK7-/CK20-。远端胃腺癌中四种免疫表型表达分别为46.9%、32.7%、8.2%和12.2%。CK7/CK20联合表达在贲门腺癌和远端胃腺癌中无明显差异（P>0.05）,而且与不同部位胃癌分化程度无明显相关性（P>0.05）。第二部分:贲门腺癌与远端胃腺癌组织p14^ARF和p16^INK4a蛋白表达及其意义的对比研究目的:比较贲门腺癌和远端胃腺癌组织中p16^INK4a和p14^ARF蛋白表达的差异。方法:重新选取贲门腺癌44例和远端胃腺癌40例,同时取正常胃黏膜（同期胃癌手术切除的未受累的胃残端）25例作为对照。采用免疫组织化学方法检测p16^INK4a和p14^ARF蛋白在不同部位胃癌中的表达情况。结果:2.1贲门腺癌与远端胃腺癌中p14^ARF蛋白表达的比较2.1.1 p14^ARF在贲门腺癌与远端胃腺癌组织中的表达P14^ARF蛋白阳性反应定位于细胞核和/或细胞浆。正常对照胃黏膜组织中p14^ARF阳性表达率明显高于胃癌组织（84.0% vs 45.2%, P<0.05）。在不同部位的胃癌病例中,贲门腺癌中阳性表达率明显低于远端胃腺癌（34.1% vs 57.5%, P<0.05）。2.1.2贲门腺癌和远端胃腺癌p14^ARF表达的临床病理意义的对比分析:远端胃腺癌中p14^ARF蛋白的表达与患者年龄、性别、肿瘤组织分化程度及淋巴结转移均无明显相关（P>0.05）。而贲门腺癌组织中,低分化腺癌p14^ARF阳性表达率明显低于高分化腺癌（18.5% vs 58.8%, P<0.05）;伴有淋巴结转移癌组织阳性表达比无淋巴结转移明显降低（17.4% vs 52.4%, P<0.05）。贲门腺癌中p14^ARF蛋白的表达与患者年龄、性别无明显相关（P>0.05）。p14^ARF阳性表达率在低分化的贲门腺癌和低分化远端胃腺癌组织的表达存在差异,低分化远端胃腺癌组织比贲门腺癌组织p14^ARF蛋白表达明显增高（55.2% vs 18.5%, P<0.05）。同时,伴有淋巴结转移的贲门腺癌组织p14^ARF阳性表达明显低于远端胃腺癌（17.4% vs 57.1%, P<0.05）。2.2贲门腺癌和远端胃腺癌中p16^INK4a蛋白表达的比较2.2.1 p16^INK4a在贲门腺癌与远端胃腺癌组织中的表达情况免疫组织化学结果显示,胃癌组织中p16^INK4a蛋白阳性表达率为58.3%（49/84）,比正常胃黏膜表达明显降低（96.0%, P<0.05）。贲门腺癌组织p16^INK4a阳性表达明显低于远端胃腺癌（43.2% vs 75.0%, P<0.05）。2.2.2 P16^INK4a表达与贲门腺癌和远端胃腺癌临床病理资料关系的对比分析p16^INK4a蛋白在贲门腺癌和远端胃腺癌中的表达与患者年龄、性别、肿瘤组织分化程度及淋巴结转移均无明显相关（P>0.05）。低分化贲门腺癌中p16^INK4a表达比低分化远端胃腺癌中明显降低（37.0% vs 72.4%, P<0.05）。伴有淋巴结转移的贲门腺癌中p16^INK4a阳性表达明显低于伴有淋巴结转移的远端胃腺癌（39.1% vs 75.0%, P<0.05）。第三部分:贲门腺癌与远端胃腺癌组织p14^ARF和p16^INK4a基因缺失的比较目的:比较贲门腺癌和远端胃腺癌中p16^INK4a和p14^ARF抑癌基因位点缺失。方法:选取贲门腺癌44例和远端胃腺癌40例,取正常胃黏膜（同期胃癌手术切除的未受累的胃残端）15例作为对照。分别提取组织DNA,采用PCR方法检测p16^INK4a（E1α和E2外显子）和p14^ARF外显子（E1β和E2外显子）的缺失情况。结果:3.1贲门腺癌和远端胃腺癌组织中p16^INK4a基因E1α和E2外显子缺失的对比PCR结果显示,正常胃黏膜组织E1α和E2未见缺失。84例胃癌中E1α、E2单纯性缺失率分别为9.5%（8/84）和8.3%（7/84）。p16^INK4a基因E1α和E2外显子总缺失率为17.9%（15/84）。在44例贲门腺癌中,E1α缺失4例（9.1%）,E2缺失5例（11.4%）,E1α和E2总缺失率为20.5%（9/44）。而在40例远端胃腺癌组织中E1α、E2单纯性缺失分别为10.0%（4/40）和5.0%（2/40）,E1α和或E2总缺失率为15.0%（6/40）。统计结果显示,在贲门腺癌和远端胃腺癌中E1α、E2单纯缺失及p16^INK4a基因E1α和E2外显子总缺失率均无明显差异（P>0.05）。3.2贲门腺癌和远端胃腺癌组织中p14^ARF基因E1β和E2外显子缺失的对比正常胃黏膜组织中E1β、E2未见缺失。84例胃癌中E1β、E2单纯性缺失率分别为6.0%（5/84）和8.3%（7/84）。p14^ARF基因E1β和E2外显子缺失率为14.3%（12/84）。在贲门腺癌中,E1β缺失3例（6.8%）,第二外显子E2缺失5例（11.4%）。p14^ARF基因E1β和E2外显子总的缺失率为18.2%（8/44）;而在远端胃腺癌组织中E1β、E2单纯性缺失率分别为5.0%（2/40）和5.0%（2/40）,p14^ARF基因E1β和E2外显子总缺失率为10.0%（4/40）。统计结果显示,贲门腺癌和远端胃腺癌中E1β、E2单纯性缺失及p14^ARF基因E1β和E2外显子总缺失率无明显差异（P>0.05）。3.3 p14^ARF和p16^INK4a在胃癌中的表达与基因缺失的关系分析在84例胃癌中,p16^INK4a蛋白表达阴性者为35例,p16^INK4a基因E1α和E2外显子总缺失为15例,并且在这15例胃癌组织中p16^INK4a蛋白的表达均为阴性。在84例胃癌中,p14^ARF蛋白表达阴性者为46例,而p14^ARF基因E1β和E2外显子总缺失为12例,12例胃癌组织中p14^ARF蛋白的表达均为阴性。上述结果提示,p14^ARF和p16^INK4a基因缺失是引起其蛋白表达失活的机制之一。第四部分:贲门腺癌与远端胃腺癌组织p16^INK4a和p14^ARF基因甲基化的对比研究目的:比较不同部位胃癌中p16^INK4a和p14^ARF基因CpG岛甲基化情况,分析贲门腺癌和远端胃腺癌中p16^INK4a和p14^ARF失活的机制。方法:本实验采用甲基化特异性PCR（Methylmion Specific PCR,MSP）对52例贲门腺癌、39例远端胃腺癌以及15例正常胃黏膜组织中p16^INK4a和p14^ARF甲基化水平进行检测;同时提取10例贲门腺癌和8例远端胃腺癌新鲜组织总RNA,运用Real-time PCR方法检测胃癌组织中p16^INK4a和p14^ARF mRNA的表达。结果:4.1 p14^ARF启动子区甲基化检测结果4.1.1 p14^ARF在贲门腺癌与远端胃腺癌组织中甲基化水平的比较MSP检测结果发现,15例正常胃黏膜中有2例发生p14启动子区甲基化,甲基化率为13.3%;胃癌组织p14^ARF甲基化率为56.0%（51/91）,明显高于正常胃黏膜（P<0.05）。贲门腺癌和远端胃腺癌的甲基化率分别为61.5%和43.6%,二者均比正常胃黏膜p14^ARF甲基化率增高（P<0.05）。同时,贲门腺癌组织中p14^ARF甲基化水平高于远端胃腺癌（P<0.05）。4.1.2 p14^ARF甲基化与贲门腺癌和远端胃腺癌临床资料的关系远端胃腺癌中p14^ARF甲基化率与患者年龄、性别、肿瘤组织分化程度及淋巴结转移均无明显相关（P>0.05）。贲门腺癌组织中,低分化腺癌p14^ARF甲基化率为78.1%,明显高于高分化腺癌（45.5%, P<0.05）。贲门腺癌中p14^ARF甲基化率与患者年龄、性别及淋巴结转移均无明显相关（P>0.05）。进一步研究发现,低分化贲门腺癌与低分化远端胃腺癌组织相比,p14^ARF甲基化率明显不同。在低分化贲门腺癌组织中p14^ARF甲基化率明显高于低分化远端胃腺癌组织（78.1% vs 48.0%, P<0.05）。4.2胃癌中p16^INK4a启动子区甲基化检测结果4.2.1 p16^INK4a在贲门腺癌与远端胃腺癌组织中的甲基化情况结果表明,91例胃癌组织中有58例发生p16^INK4a甲基化现象,甲基化率为63.7%,比正常胃黏膜p16^INK4a甲基化明显增高（20.0%, P<0.05）。贲门腺癌和远端胃腺癌组织中p16^INK4a甲基化阳性率分别为73.1%和51.3%,均高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。同时,贲门腺癌组织中p16^INK4a甲基化率明显高于远端胃腺癌,统计有显著差异（P<0.05）。4.2.2 p16^INK4a甲基化与贲门腺癌和远端胃腺癌临床资料的关系贲门腺癌组织和远端胃腺癌组织中,p16^INK4a甲基化与患者年龄、性别、肿瘤组织分化程度及淋巴结转移均无明显相关（P>0.05）。进一步研究发现,低分化程度贲门腺癌组织p16^INK4a甲基化明显高于远端胃腺癌（81.3% vs 56.0%;P<0.05）。4.3胃癌中p14^ARF和p16^INK4a基因甲基化与其mRNA表达的相关性分析选取18例新鲜组织,其中贲门腺癌10例、远端胃腺癌8例。根据MSP检测结果显示p14^ARF甲基化阳性10例,阴性8例;p16^INK4a甲基化阳性9例,阴性9例。采用Real-time PCR技术检测了p14^ARF和p16^INK4a mRNA的表达情况,发现发生甲基化的胃癌组织p14^ARF和p16^INK4a mRNA水平均明显低于非甲基化组。结果提示胃癌组织中p14^ARF和p16^INK4a启动子区甲基化可致其mRNA表达明显降低（P<0.05）。结论:1贲门腺癌组织中CK14表达明显高于远端胃腺癌,而MUC2表达明显低于远端胃腺癌组织,提示贲门腺癌可能在组织分型及组织学来源方面与远端胃腺癌有所不同。2贲门腺癌组织中p14^ARF和p16^INK4a蛋白的表达均明显低于远端胃腺癌组织,且p14^ARF的表达与肿瘤分化程度及淋巴结转移密切相关;而在远端胃腺癌中其表达与肿瘤分化程度及淋巴结转移均无明显相关。因此,贲门腺癌与远端胃腺癌组织中抑癌基因p14^ARF和p16^INK4a在蛋白水平上的表达及其意义均存在差异。3 p14^ARF和p16^INK4a基因外显子缺失的贲门腺癌和远端胃腺癌组织中,其相应蛋白的表达也为阴性。但是,在贲门腺癌和远端胃腺癌中p14^ARF和p16^INK4a基因缺失率无明显差异,可能与胃癌发生部位无关。4 p14^ARF和p16^INK4a基因甲基化水平在贲门腺癌组织中明显高于远端胃腺癌组织,提示启动子区甲基化水平的差异可能是贲门腺癌与远端胃腺癌p14^ARF和p16^INK4a表达差异的原因之一。