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背景:肠缺血再灌注损伤(intestinal ischemia-reperfusion injury,I/RI)是临床上常见的危重病症之一,可常继发于肠系膜血栓疾病、各种休克、小肠移植等疾病。肠I/R不仅会导致小肠局部的损伤,随着病程的发展更会引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)以及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),对病人的生命造成严重的威胁。FBXW7作为一个泛素连接酶SCF的识别亚基在肠道肿瘤、氧化应激疾病及缺氧条件下对细胞有明显的促凋亡作用,而关于FBXW7在肠I/R中所起的作用尚未可知。热休克转录因子1(heat shock transcription factor,HSF1)能直接调节热休克蛋白(heat shock protein,HSP)的转录,其中热休克蛋白HSP27和HSP70在缺血再灌注过程中能起抑制凋亡作用,从而器官缺血再灌注疾病中起重要的保护作用。近期研究表明FBXW7能通过介导HSF1的泛素化降解,起促进凋亡作用。关于FBXW7/HSF1信号通路在肠I/R损伤中作用的研究目前尚未见报道。目的:探讨FBXW7介导的HSF1泛素化降解在I/R条件下肠上皮细胞凋亡过程中所起的作用,阐明应用si RNA敲减FBXW7预处理能通过减少HSF1的泛素化降解,提升HSP27和HSP70的表达,减少肠长皮细胞凋亡,从而在肠I/R损伤中起保护作用。方法:1、动物实验:25只雄性C57小鼠随机平均分成5组,假手术组(control组)、缺血再灌注2小时组(45min/2h)、缺血再灌注4小时组(45min/4h)、缺血再灌注6小时组(45min/6h)、缺血再灌注8小时组(45min/8h)(前为缺血时间,后为再灌注时间)。检测小鼠小肠在缺血45分钟后,不同的再灌注时间点小肠组织匀浆中FBXW7的蛋白水平变化;选取Control组与缺血再灌注6小时组用HE染色检测小肠组织的病理损伤情况,采用Tunel方法检测小肠组织原位细胞凋亡情况。2、人体标本:人体正常小肠组织和缺血小肠组织标本各3份,对照组(正常小肠组织)、缺血组(缺血小肠组织),随机切取小肠黏膜组织,提取细胞匀浆,利用Western-blotting方法检测小肠黏膜匀浆中FBXW7蛋白水平。3、细胞实验:1、人源结肠癌细胞Caco2细胞均匀铺于6孔板中,分成2组。对照组(control组),实验组(缺氧复氧组)。待细胞融合度为70-80%时,进行缺氧12小时复氧6小时造模。造模结束后,收集细胞,提取蛋白匀浆,采用Western-blotting方法检测FBXW7蛋白水平,利用免疫共沉淀方法检测FBXW7与HSF1结合情况,用免疫共沉淀及Western-blotting方法检测HSF1的泛素化水平变化,利用免疫荧光方法检测HSF1在造模后在细胞核中量的变化。2、人源结肠癌细胞Caco2细胞均匀铺于6孔板中,分成4组,空白对照组(Control+DMSO)、空白给药组(Control+MG132)、模型对照组(H/R+DMSO)、模型给药组(H/R+MG132),利用MG132抑制蛋白酶体功能,缺氧复氧造模后,收集细胞,提取蛋白匀浆,采用Western-blotting方法检测FBXW7及HSF1的蛋白水平变化。3、Caco2细胞均匀铺于6孔板中,分成4组,空白对照组(Control+NCRNA)、空白干扰组(Control+si RNA)、模型对照组(H/R+NCRNA)、模型干扰组(H/R+si RNA),利用si RNA敲减FBXW7,缺氧复氧造模后,收集细胞,提取蛋白匀浆,采用Western-blotting方法检测FBXW7、HSF1蛋白水平,HSF1调控转录的HSP27和HSP70的蛋白水平及凋亡相关蛋白cleaved-Caspase 3(C-cas 3)和cleaved-caspase9(C-cas 9)蛋白水平变化,采用免疫共沉淀及Western-blotting方法检测HSF1的泛素化水平变化,采用TUNEL法检测Caco2细胞凋亡情况。结果:1、FBXW7水平变化:(1)动物实验:与control组相比,随着再灌注时间增长,小鼠小肠组织匀浆中FBXW7蛋白水平明显升高且呈再灌注时间依赖性,于再灌注6h时达到最高。(2)人体标本:缺血小肠黏膜匀浆中FBXW7蛋白水平明显高于正常小肠黏膜。(3)细胞实验:缺氧复氧实验组细胞匀浆中FBXW7蛋白水平明显高于对照组。2、在Caco2细胞中,与对照组相比,缺氧复氧造模试验组Caco2细胞中FBXW7与HSF1的结合明显增加,HSF1的泛素化水平亦显著增加,HSF1在核内蓄积明显。使用MG132抑制蛋白酶体后,与空白相比,空白给药组细胞匀浆中FBXW7蛋白水平未见明显变化,但HSF1蛋白水平明显升高,模型组与模型给药组相比亦呈现同样的趋势。3、敲减FBXW7后,FBXW7蛋白表达水平显著降低,Caco2细胞生存率明显升高,TUNEL凋亡检测显示Caco2细胞凋亡率下降。HSF1、HSP27、HSP70蛋白水平明显升高,C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平明显下降。HSF1蛋白泛素化水平明显下降。4、结论:1、肠缺血灌注可引起小肠组织中FBXW7表达水平升高,进而增加了HSF1的泛素化降解。2、敲减FBXW7后,FBXW7表达下调,HSF1泛素化降解减少,进而使HSP27和HSP70表达升高,使Caspase-3和Caspase-9激活减少,从而抑制细胞凋亡,对肠缺血再灌注起保护作用。