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食品中常见的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一,可导致多种疾病发生,严重威胁着人们的健康。快速、准确的检测食品中的致病菌是有效预防和控制病原菌感染的前提条件。本文的研究目的是建立一种利用寡核苷酸芯片快速检测奶粉中常见致病菌的方法,检测的目的菌株包括坂崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯氏菌、沙门氏菌和志贺氏菌。
我们通过对坂崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯氏菌、沙门氏菌16S-23S rDNA间区以及志贺氏菌的ipaH基因的分析,确定用于检测的靶基因为16S-23S rDNA间区和ipaH基因。在16S rDNA的末端和23S rDNA的前端设计通用引物,而在间区可变区设计特异性探针。用Primer premier5.0软件分别设计出6种致病菌的特异探针,同时设计了所有细菌的正对照探针及阴性对照探针,将探针poly(T)加尾后固定在载玻片上,制成寡核苷酸芯片;提取细菌DNA后PCR扩增,纯化扩增产物去除引物,用下游引物进行单链PCR,同时掺入Cy3_dUTP标记反义链,荧光标记后的产物和寡核苷酸芯片上的探针杂交,洗涤后用荧光扫描仪检测杂交信号。对检测体系进行了特异性、灵敏性及模拟样品实验。
通过148株菌包括104株代表菌株和39临床菌株对检测体系进行了测试,均显示了该寡核苷酸芯片的高特异性;该方法可最低检测出103CFU/mL的纯菌。实验结果表明运用寡核苷酸芯片技术所建立的检测方法准确、可靠、实用性强,本文所建立的检测方法为今后在食源性致病菌检测、鉴定领域开展进一步的研究和更人规模的使用奠定了可靠的理论与技术基础。