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家蚕(Bombyx mori)是一种能吐丝的经过家养驯化的鳞翅目昆虫,兼具重要的经济价值和学术价值。家蚕因为其强大的合成和分泌丝蛋白(丝素和丝胶)能力而备受人类关注,并且由于在昆虫中相对较好的研究基础以及相对简单的饲养条件,使得家蚕被普遍接受为鳞翅目昆虫的模式生物。家蚕丝腺是合成和分泌丝蛋白的特殊器官,从形态和功能上可以分为三部分:前部丝腺(ASG)、中部丝腺(MSG)和后部丝腺(PSG)。丝蛋白的大量合成和分泌是在五龄起第3日开始的,后部丝腺特异性的合成和分泌丝素蛋白,而中部丝腺特异性地合成和分泌丝胶蛋白。两种丝蛋白基因的时间特异性和组织特异性表达现象,引起了研究者们广泛的兴趣。基因表达受多种调控因子的多级调节,其中启动子的调控占有十分重要的地位。因此,研究丝蛋白基因启动子的功能序列对于深入了解基因的表达调控机制具有十分重要的意义。目前已有5种丝胶基因被克隆和分离,分别被称为Ser1、Ser2、MSGS3、MSGS4和MSGS5,其中Ser1基因是丝胶蛋白的主要表达基因。Liu Y等利用重组AcMNPV介导的体内瞬时表达方法,对Ser1基因的启动子序列进行部分删除,通过分析EGFP报告基因的表达,研究了Ser1启动子序列中与丝腺组织专一性表达相关的元件[1]。为了更加准确地对家蚕丝胶1基因的启动子进行研究,本文利用rAcMNPV作为基因介导的载体[2],构建了一个FHNLuc-A3RL双荧光质粒,其中萤火虫荧光素酶(FLuc)基因由被研究启动子带动,另一个由家蚕actin3启动子控制的水母荧光素酶(RLuc)作内参。并对Ser1启动子进行了删减、缺失后插入到FLuc前,通过分析FLuc报告基因与RLuc报告基因的荧光素酶活性,进一步研究了Ser1启动子序列中与丝胶基因表达相关的区域。首先,构建了一个双荧光供体质粒,对1.6 kb的Ser1基因启动子进行了5’端分段顺次缺失,用PCR方法扩增得到5种不同长度的Ser1启动子序列,加上Ser1基因全长启动子,将这5种Ser1启动子序列分别装入双荧光质粒FHNLuc-A3RL中,成功获得6种重组的转移载体:FSer1600Luc-A3RL , FSer600Luc-A3RL , FSer500Luc-A3RL , FSer492Luc-A3RL ,FSer484Luc-A3RL和FSer475Luc-A3RL,通过Bac-to-Bac系统[3]制备6种重组杆状病毒Ac1600ser、Ac600ser、Ac500ser、Ac492ser、Ac484ser和Ac475ser。这些重组病毒分别注射感染五龄起家蚕,测定FLuc和RLuc的酶活发现:Ser1启动子的基本转录元件在转录起点上游475 bp范围内。但长短不同的启动子之间,其相对活性值还是有差异的,在?1600到?475区间中也可能存在一些调控元件,但对Ser1基因的基本转录影响不大。其次,为了进一步分析Ser1启动子上几个特殊的顺式调控原件的作用,对上游-475启动子进行了内部部分删除分析,其中一个是富含AT的SA区域,一个是CAAT位点,一个是TATA盒。使用PCR技术产生了3个有缺失的启动子片段。同样将这3个不同缺失的启动子装入双荧光pFHNLuc-A3RL质粒中,构建携带双报告基因的重组杆状病毒Acser475SA-,Acser475CAAT-和Acser475TATA-,体腔注射五龄起蚕,测定报告基因FLuc和RLuc的活性。结果显示:SA区域和CAAT区域的缺失,对启动子的活性有很大影响。