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背景在我国,食管癌(Esophageal cancer,EC)是目前引起肿瘤相关性死亡的第三大恶性肿瘤,其中食管癌的深度浸润和转移是引起食管癌患者死亡的主要原因。二甲双胍属于双胍类口服降糖药,通常用于2型糖尿病的治疗。最近,越来越多的流行病学数据和临床前研究证明了二甲双胍在广泛的癌症类型中的抗肿瘤作用,包括食管癌。大量研究发现二甲双胍的抗肿瘤作用与许多信号通路有关,但其具体作用机制尚未明确。长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)在广泛的癌症中表达,并在肿瘤的整个进展过程及放化疗抗性中起关键作用。已经证实lncRNAs参与二甲双胍介导的抗肿瘤过程,并且一些研究已经证实了lncRNAs在食管鳞状细胞癌(esophagus squamous cell carcinomas,ESCC)中的重要性。然而,在ESCC中,lncRNAs在二甲双胍介导的抗肿瘤过程中的作用及机制尚未见相关报道。本研究将探讨在ESCC中,lncRNAs在二甲双胍介导的抗肿瘤过程中的潜在作用及其可能机制。目的发现与二甲双胍介导的增殖和迁移抑制过程相关的lncRNAs,阐明lncRNAs在二甲双胍介导的增殖和迁移抑制过程中的作用,探讨lncRNAs在二甲双胍介导的增殖和迁移抑制过程中的作用机制,从而为临床食管癌的治疗提供新的靶点。方法(1)用不同浓度的二甲双胍处理食管癌细胞,MTT法检测ESCC细胞的存活率;细胞划痕实验和Transwell体外迁移实验检测ESCC细胞迁移能力;(2)用Opti-MEM I和Lipofectamine2000试剂(Invitrogen,CA,USA)转染过表达载体pcDNA3.1-CCAT1(CCAT1)、pcDNA3.1-SPRY4-IT1(SPRY4-IT1)以及空载体pcDNA3.1(作为对照),二甲双胍加药处理。Real-time PCR法检测ESCC细胞中CCAT1和SPRY4-IT1 RNA表达情况;Western blot法检测ESCC细胞中Vimentin和c-Myc蛋白表达的情况。(3)采用SPSS 21.0对数据进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.二甲双胍以剂量依赖性方式抑制ESCC细胞的增殖和迁移:MTT法实验结果显示,不同浓度的二甲双胍(2.5,5,10,20,40mM)对食管癌Eca-109细胞的体外存活能力均有抑制作用(P<0.05),并且随着二甲双胍浓度的提高以及处理时间的延长,抑制作用逐渐增强(P<0.001)。这一结果表明在一定浓度和时间范围内,二甲双胍对Eca-109细胞体外存活能力的抑制呈现时间-剂量依赖性,在其它ESCC细胞系(EC9706、TE1、TE7)中也观察到二甲双胍对ESCC细胞体外存活率的抑制作用(P<0.05)。划痕实验结果显示,不同浓度的二甲双胍(1.25,2.5,5,10,20mM)对食管癌Eca-109细胞的体外迁移均有抑制作用,并且随着二甲双胍浓度的提高抑制作用逐渐增强(P<0.05)。Transwell体外迁移实验结果显示,不同浓度的二甲双胍(5,10 mM)对食管癌Eca-109、TE-1细胞的体外迁移均有抑制作用(P<0.001)。2.CCAT1和SPRY4-IT1是ESCC细胞中受二甲双胍影响最显著的LncRNA:RT-PCR法实验结果显示:用二甲双胍(10mM)处理ESCC细胞48 h后,7个LncRNA中的2个:CCAT1和SPRY4-IT1在Eca-109和TE1细胞中均显著下调(P<0.001)。用不同浓度的二甲双胍(0,2.5,5,10mM)处理Eca-109细胞48h,发现CCAT1和SPRY4-IT1的水平均以剂量依赖性方式下调(P<0.05)。3.CCAT1和SPRY4-IT1的过表达逆转了二甲双胍对ESCC细胞增殖和迁移的抑制作用:用空载体(pcDNA3.1),表达CCAT1的质粒(CCAT1)或表达SPRY4-IT1的质粒(SPRY4-IT1)转染Eca-109细胞48h后,RT-PCR实验结果显示,Eca-109细胞的增殖能力明显提高。二甲双胍抑制Eca-109细胞的增殖,而CCAT1或SPRY4-IT1的过表达逆转了二甲双胍对Eca-109细胞的增殖抑制作用(P<0.001)。在细胞迁移方面观察到类似的现象。细胞划痕和transwell实验结果显示,Eca-109细胞的迁移能力增加。二甲双胍抑制了Eca-109细胞的迁移,并且两种lncRNAs中任一种的过表达减轻了这种抑制(P<0.001)。4.二甲双胍抑制ESCC细胞中Vimentin和c-Myc的表达:用不同浓度的二甲双胍(0,2.5,5,10mM)处理ESCC细胞(Eca-109、TE1)48h。Western blot法实验结果显示,二甲双胍以剂量依赖性方式降低了Vimentin和c-Myc的蛋白表达水平(P<0.05)。5.二甲双胍通过CCAT1和SPRY4-IT1调节c-Myc和Vimentin水平:在Eca-109细胞中过表达pcDNA3.1,CCAT1或SPRY4-IT1。然后用二甲双胍(0或10mM)处理细胞24h。RT-PCR显示四组中CCAT1和SPRY4-IT1的RNA水平(P<0.001)。Western blot结果显示,CCAT1上调了c-Myc和Vimentin的蛋白水平(P<0.01)。二甲双胍降低了c-Myc和Vimentin的蛋白水平(P<0.001),CCAT1的过表达也可以部分逆转这种情况(P<0.01)。在SPRY4-IT1转染的细胞中也观察到类似的现象。通过过表达SPRY4-IT1,发现Vimentin和c-Myc水平增加(P<0.01)。二甲双胍对Vimentin和c-Myc的下调也至少部分的通过SPRY4-IT1的过表达来解救(P<0.05)。6.人食管癌组织中CCAT1与c-Myc呈正相关:通过RT-PCR测量了15对ESCC组织和邻近正常组织中c-Myc,CCAT1和SPRY4-IT1的表达。我们的结果显示,与正常组织相比,ESCC组织中CCAT1水平明显上调,CCAT1上调率为10/15(66.7%)(P<0.05)。与正常组织相比,在ESCC组织中SPRY4-IT1和c-Myc水平也显著上调。SPRY4-IT1和c-Myc的上调率分别为11/15(73.3.7%)和12/15(80%)(P<0.05)。此外,我们观察到CCAT1水平与c-Myc mRNA水平呈正相关(r2=0.306,P<0.05),而SPRY4-IT1水平与c-Myc mRNA水平之间未发现相关性(r2=0.0748,P>0.05)。这些数据表明,在人ESCC组织中,CCAT1和SPRY4-IT1的RNA水平显著增加,并且CCAT1和c-Myc之间存在正相关。结论1.二甲双胍可能通过调节2个lncRNAs(CCAT1和SPRY4-IT1)抑制ESCC细胞的增殖和迁移。2.在人ESCC组织中CCAT1的RNA表达与c-Myc呈正相关性。3.在ESCC中,CCAT1和SPRY4-IT1是二甲双胍的治疗靶点。