近些年来,革兰阴性杆菌的耐药情况日益严重,主要以肠杆菌科细菌和非发酵革兰阴性杆菌为主,而耐碳氢酶烯类抗生素耐药菌的不断出现加剧了这种情况,临床上以肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌耐药最为严重,使感染性疾病的治疗陷入困境。2009年,产NDM-1(新德里金属β-内酰胺酶)耐药菌的出现和流行引起了世界范围内的恐慌,携带NDM-1的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌表现出了超强的耐药性,对包括碳青霉烯类在内的临床常用的抗生素耐药,到2011年,在全球范围内超过20个国家出现了NDM-1耐药菌的报道,多数患者有印度等国家医疗旅行史,越来越多的数据表明产NDM-1的耐药菌已经呈全球范围播散趋势,有可能成为威胁人类健康的巨大隐患。目前,我国产NDM-1耐药菌的流行情况、携带NDM-1菌株的特性及其播散的机制仍不清楚。国外NDM-1携带者多有印度和巴基斯坦旅行和医疗史,印度被认为是NDM-1耐药菌的输出国家,我国与印度毗邻,其NDM-1耐药菌的流行是否和印度有关仍没有明确定论。研究证明人体肠道是重要的耐药基因库,致病菌可以在肠道内发生接合转移获得耐药基因,在肠道定植的菌中携带的耐药基因有一半与致病菌中相同,因此美国疾病预防控制中心推荐通过采集患者粪便标本来筛查CRE(耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌)携带者,以便及时采取措施预防和控制感染。基于上述研究,我们从2011年4月至2011年10月,在全国范围内选取了11个城市22家医院,共收集了3001份粪便样本,常规PCR和阳性产物再测序筛选NDM-1阳性样本,然后从鉴定为阳性的样本中分离出NDM-1耐药菌,利用BIOLOG自动微生物鉴定系统和16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。其中对分离出的不动杆菌属细菌再次利用16S-23S rRNA ITS区序列和rpoB基因序列测序进行菌种鉴定。在筛查的3001份样本中,一共鉴定出329份阳性样本,平均阳性率为11%,阳性率较高的城市有重庆(17.6%)和成都(17.2%),较低的有南京(4.0%)和乌鲁木齐(4.4%),在所有调查的城市中均存在阳性样本。从329份阳性的菌液中,一共分离出63株NDM-1阳性菌,菌种鉴定结果显示数目最多的是不动杆菌属细菌(30株),其次是肠球菌(10株)。含NDM-1的菌种种类较多,分别属于不同的16个属的细菌,其中共发现18个未报道过的含NDM-1的耐药菌。另外我们发现有些阳性样本分离出不止一株NDM-1耐药菌,其中有9个样本每个样本分离出2个不同的NDM-1耐药菌,还有1个样本分离出3株不同的NDM-1阳性菌,在这10个特殊的样本中有9个样本中分离的菌中含有不动杆菌。另外病例资料显示我们收集的患者均无出国医疗史。通过上述研究我们发现NDM-1耐药菌在医院患者身上携带率较高,已经在全国范围内流行和传播；我国分离的NDM-1菌株的菌种类型独特,以不动杆菌属细菌(30/63)和肠球菌属细菌(10/63)多见；不动杆菌属细菌在中国NDM-1的传播过程中起到了重要作用,不动杆菌属细菌可能是NDM-1基因的保存宿主；我国的NDM-1耐药菌的流行与印度可能无关。我们对NDM-1耐药菌的特性进行了进一步研究,首先在有抗和无抗条件下连续传代,分析blaNDM-1基因在菌株中的遗传稳定性。Walsh等的研究表明不能够稳定遗传6blaNDM-1基因的菌株不具备典型的NDM-1耐药菌的耐药性,所以我们对能够稳定遗传blaNDM-1基因的菌株进行重点研究,首先微量肉汤稀释法和E-test法检测菌株对抗菌药物的敏感性,E-test法检测细菌金属酶表型；然后PCR法筛选常见的耐药基因,分析菌株的耐药基因背景；PFGE对细菌分型,查看有无流行克隆株；Southern blot对b laNDM-1进行基因定位；接合转移实验评估blaNDM-1质粒转移特性,同时微量肉汤稀释法评估了blaNDM-1阳性接合子的耐药性。我们发现在63株NDM-1耐药菌中只有30株不动杆菌属的细菌能够稳定遗传blaNDM-1基因,在有抗和无抗的压力下连续培养5代,所有的菌株未出现blaNDM-1基因丢失现象,然而其余菌株,包括一株大肠埃希菌和产酸克雷伯菌在内的15个属种的细菌在无抗的压力下连续传代培养1-3代,blaNDM-1基因均发生丢失。体外的药敏实验表明30株不动杆菌表现出相似的表型耐药模式,对头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素表现出高水平耐药,对氨基糖苷类抗生素、喹诺酮类抗生素及单酰胺环类抗生素(氨曲南)耐药表现不一致：10株测试菌对氨基糖苷类抗生素表现为敏感,其余菌株(20/30)表现为耐药或中度耐药；3株测试菌对喹诺酮类抗生素表现为敏感,其余菌株(27/30)表现为耐药或中度耐药；17株测试菌对氨曲南表现为敏感,其余菌株(13/30)表现为耐药或中度耐药；30株测试株中,29株对替加环素表现为敏感,24株对黏菌素表现为敏感。携带NDM-1的不动杆菌属细菌金属酶表型均为阳性。耐药基因背景筛查结果显示在30株不动杆菌属细菌,有22株细菌含有其他耐药基因。PFGE结果显示不动杆菌属细菌带型差异较大,没有发现优势克隆株。Southern blot结果显示30个不动杆菌中有26个菌blaNDM-1位于质粒上,质粒大小相似,在30-60kb范围内,其余4个菌blaNDM-1位于染色体上。接合转移实验显示有23个菌株中的blaNDM-1质粒发生了转移,接合转移效率较高,达到10-2,同时药敏结果显示阳性接合子普遍对头孢菌素类抗生素表现为耐药,然而只有部分菌株(8/23)遗传NDM-1原始菌株的耐药性,对碳青霉烯类抗生素表现耐药,其余接合子(15/23)对其表现敏感。通过上述研究我们发现NDM-1阳性的不动杆菌属细菌并非泛耐药菌,体外实验表明除替加环素和黏菌素外,多数菌株还对氨曲南保持敏感。blaNDM-1基因能够稳定地存在于不动杆菌携带的质粒上,并且这些质粒能够高效地发生接合转移,这对blaNDM-1基因的传播具有重要意义。为了研究blaNDM-1基因所在的质粒及周围序列特征,以期从分子水平上揭示耐药基因的产生及传播机制。本研究提取细菌的质粒利用Ion TorrentTM平台进行测序,然后普通PCR测序补充gap,同时验证质粒全序。RAST对质粒进行注释,Blastp进行验证。利用Mauve和CLC Genomics Workbench软件对所有blaNDM-1质粒进行分析,对比所有的质粒,找出它们的区别和差异,同时对blaNDM-1基因上下游序列进行分析,对于blaNDM-1基因位于染色体上的4个菌,PCR mapping推测其上下游序列。结合有关NDM-1的文献,推测NDM-1的传播和流行规律。blaNDM-1质粒测序结果显示,有14个质粒与已经公布的4个质粒相同(pNDM-BJ01、pNDM-BJ02、pM131_NDM-1和pAbNDM-1),这4个质粒本身之问相似性较高,达到80%；另外10个质粒为新的质粒,对比分析之后,发现这10个质粒与上述的4个质粒仍然有较高的相似性(70%-90%)。由此我们得到不动杆菌属细菌中blaNDM-1质粒保守,质粒问的相似程度较高,质粒的不同多为在转移的过程中不动杆菌属细菌中常见的插入序列整合引起的。同时实验发现两个结构全新的质粒,pNDM-GJO1和pNDM-GJ02, pNDM-GJ01拥有一个新的质粒骨架,BLAST结果显示除了Tn125外,NCBI中没有与pNDM-GJ01相似的序列。另外对pNDM-GJ02的结构进行分析显示,质粒pNDM-GJ02上有两段分别与鲍曼不动杆菌中质粒pBJAB0715和Acinetobacter sp. MDS7A染色体上序列有较高的同源性(97%-100%),除此之外,质粒还含两个完整的复合转座子,Tn125和IS26复合转座子,pNDM-GJ02质粒的形成可能是由多次重组事件造成的。由此不动杆菌属细菌中b laNDM-1新质粒的产生是Tn125移动整合的结果。blaNDM-1基因通过转奎元件在不同质粒问传播,继而以质粒为转移元件继续播散。通过比对30株不动杆菌属细菌中blaNDM-1基因周围序列,发现blaNDM-1位于Tn125-like结构上,周围序列非常保守。结合文献我们认为blaNDM-1基因可能来源于不动杆菌属细菌,不动杆菌属细菌是blaNDM-1基因的天然宿主,blaNDM-1基因可以通过转座元件转移至肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中,再次引起爆发流行。另外我们发现了NDM-1的一个新的突变体,命名为NDM-14。为了研究新的突变体的特性,首先比较携带NDM-1和NDM-14原始菌株的耐药性差别,同时构建两种克隆株比较耐药性差异,最后利用合适的载体,经过两次纯化得到无标签的NDM蛋白,通过酶动力学实验研究酶的各项特征。实验结果显示,与携带NDM-1的菌株相比,携带NDM-14的菌株耐药性增强,这种情况在原始启动子存在的情况下尤为明显。酶动力参数表明,与NDM-1相比,NDM-14对美罗培南,亚胺培南和氨苄西林的亲和力增强。宗上所述,推测：1)我国产NDM-1菌株是个独立进化的过程,NDM-1耐药基因的传播与印度无关,传播主要由携带相似质粒的不动杆菌属细菌造成的；2)产NDM-1菌株同时具有跨国流行及个别地方流行的特点,许多地方可能本身就有MDM-1菌株的流行,当印度的产NDM-1菌株因医疗旅行传至全球多个国家后,引起了广泛关注,这种广泛关注增加了产NDM-1菌的检出率；3)blaNDM-1基因可能会再次爆发流行,菌株主要集中在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。