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EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)属疱疹病毒γ亚科,是重要的DNA肿瘤病毒,与鼻咽癌(NPC)、Burkitt淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多种肿瘤的发生有关。在EBV编码基因中,潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1,LMP1)编码基因已被确认具有癌基因的功能。研究表明,LMP1具有介导细胞增殖、抑制细胞凋亡和细胞分化,以及促进肿瘤的侵袭和转移等多种生物学活性。siRNA是一种短片段双链RNA分子,能以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,从而高效、特异地阻断体内特定基因的表达,诱使细胞表现出特定基因缺失表型。因此采用siRNA技术深入探讨LMP1的生物活性对于揭示EBV致癌机制以及开展EBV相关肿瘤的特异性治疗具有实际意义。本研究选择EBV阳性胃上皮细胞GT38作为靶细胞,采用人工合成的siRNA特异性阻断LMP1的表达,检测LMP1沉默对GT38增殖和凋亡的影响,探讨LMP1在EBV相关肿瘤发生发展中的分子机制,为EBV相关肿瘤的生物治疗提供实验依据。目的探讨化学合成小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)对EBV阳性胃上皮细胞(GT38)LMP1编码基因表达的抑制作用以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法①采用脂质体法分别以20、30、50、80和100nM终浓度荧光标记的阴性对照siRNA(FAM-siRNA)转染GT38细胞,转染12h内用倒置荧光显微镜检测转染效率。②化学合成靶向LMP1 mRNA 649、979和1348位点的3对siRNA,以EBVⅢ型潜伏的胃上皮细胞GT38为靶细胞,采用脂质体法分别将3组siRNA转染GT38细胞,同时设非特异性对照和细胞对照。采用RT-PCR和Western blotting检测靶基因LMP1的转录表达水平,筛选出抑制效果最为理想的siRNA链并检测对LMP1表达影响的时效关系。③选择抑制效果最好的siRNA链以最佳转染浓度转染靶细胞,采用Hoechst 33258、透射电镜和流式细胞术检测GT38细胞凋亡和周期的变化;Western blotting检测LMP1沉默对GT38细胞、细胞浆和细胞核内NFκB基因表达的影响;RT-PCR检测对Bcl-2、Bax、MMP9、ICAM-1转录表达的影响。结果①FAM-siRNA转染GT38细胞后12h各浓度组在荧光显微镜下均可观察到细胞内有点状绿色荧光出现,表明转染成功。siRNA终浓度为50,80和100nM时转染效率较高,本实验选用50nM浓度siRNA转染GT38细胞。②RT-PCR检测结果表明,与转染非特异性siRNA的细胞相比,siRNA649、siRNA979和siRNA1348对靶细胞LMP1的转录表达均具有抑制作用,差异均有统计学意义(F=235.99,P＜0.05);其中以siRNA649对LMP1转录表达的抑制作用最为明显,转染后24,48和72h时LMP1mRNA的转录水平均明显低于细胞对照组(F=89.93,P＜0.05),而转染后48和72h时LMP1mRNA的转录表达水平明显低于转染后24h时LMP1mRNA的转录表达水平。Western blotting结果显示,与细胞对照比较,转染siRNA649后48h未检测到LMP1的表达,转染后72和96h时LMP1的表达明显减弱。③Hochest 33258染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡,透射电镜观察到GT38细胞线粒体空泡化,染色质固缩;而转染非特异性对照siRNA的GT38细胞未观察到上述改变。流式细胞分析显示,与非特异性对照组和细胞对照组比较,siRNA649作用24,72以及120h后的细胞其细胞周期无明显改变。④Western blotting结果显示与细胞对照比较,siRNA649转染后GT38细胞总蛋白和核蛋白中NFκB的表达水平降低,细胞浆蛋白中NFκB表达水平增高。⑤RT-PCR检测Bcl-2、Bax、MMP9和ICAM-1 mRNA的转录表达,电泳结果显示与细胞对照比较,转染后24,48和72h GT38细胞Bcl-2(F=39.83,P＜0.05)、MMP9(F=177.47,P＜0.05)、ICAM-1(F=467.69,P＜0.05)的转录表达明显下调,差别有统计学意义,对Bax的转录表达无明显影响(F=0.75,P＞0.05),Bcl-2/Bax比值降低,差别有统计学意义(F=5.45,P＜0.05)。结论化学合成siRNA能有效抑制GT38细胞中LMP1编码基因的表达,其抑制作用具有时间依赖性,在一定浓度范围内呈明显的量效关系,且对靶基因的特定序列具有较强的选择偏向性。LMP1特异性沉默可抑制NFκB的表达和核转移,进而下调Bcl-2/Bax、MMP9、ICAM-1等下游基因的表达,最终导致靶细胞的凋亡。GT38细胞可用作研究LMP1生物活性及其在EBV相关肿瘤发生中所起作用的理想的靶细胞。