DNMT2是DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）家族的一员。DNMT2是否甲基化DNA一直有争议,但可甲基化t RNA的38位胞嘧啶,生成5-甲基胞嘧啶（5-methyl cytidine,m5C）。m5C这一修饰不仅可以防止t RNA在应激状态被剪切,而且可以维护并促进t RNA的功能,提高与转录调控及基因表达相关蛋白的翻译速度。许多文献表明,DNMT2对应激反应很重要,不仅参与应激状态下的RNA处理,而且可促进阿米巴原虫对硝化应激的耐受力,此外还参与果蝇中抗病毒的免疫应答。本实验室前期研究结果表明,在仔猪断奶应激过程中,DNMT2在小肠及肾等脏器中表达特异性地显著降低,在断奶后14天依然保持较低水平。我们推断,提高DNMT2表达水平可能有助于缓解仔猪断奶应激症状。但提高DNMT2表达水平是否真能缓解应激程度还有待于进一步研究。癌症是由遗传因素和表观遗传因素共同影响的疾病。而DNMT家族则在癌症发生过程中,对表观遗传变化起重要作用。临床研究发现DNMT2单核苷酸多态性变化与南方汉族人胃癌发病率呈正相关,而且该变化导致DNMT2蛋白H101Y点突变。但DNMT2的H101Y突变体在癌症发生过程中到底发挥什么作用,其甲基化作用相对于野生型DNMT2是否不同,这些都还有待于深入研究。对这些问题的研究将有助于探讨胃癌发病机制,并将为发现潜在的胃癌早期诊断标志提供契机。鉴于利用仔猪进行蛋白高表达试验的局限性,本论文利用小鼠慢性热应激模型,旨在探讨DNMT2对小鼠对抗慢性热应激的作用;并利用体外重组DNMT2蛋白,进行酶活性测试,探讨野生型DNMT2及其H101Y突变体的甲基化作用。具体内容如下:1.DNMT2对小鼠抗慢性热应激的影响将DNMT2克隆入真核表达质粒,获得重组质粒pc DNA3.1-DNMT2。并将其注射到小鼠体内,再分组,一组给与小鼠慢性热刺激,另一组按正常条件饲养,并同时设置未注射DNMT2真核表达质粒的对照组。生化指标显示,相对于对照组,刺激组血清葡萄糖浓度、碱性磷酸酶活性、总蛋白及白蛋白浓度均显著降低,肌酸激酶活性显著上升（P＜0.05）,证明小鼠慢性热应激模型造模成功。RT-PCR及Western Blot结果显示,与正常饲养组相比,无论注射重组质粒还是PBS组,热应激组小鼠体内DNMT2表达量显著下调,说明在应激过程中,DNMT2的表达水平受到调控,与应激反应呈负相关。在注射重组质粒组小鼠体内,无论给予热应激还是正常饲养组,DNMT2都过表达;与PBS慢性热应激组相比,重组质粒热应激组应激症状明显减轻,且能对抗应激早期日增重下降趋势,说明过表达DNMT2对于小鼠抗慢性热应激具有保护作用。2.DNMT2及其H101Y突变体的甲基化活性的探究将人DNMT2克隆入原核表达质粒,获得重组质粒pET28a-DNMT2。然后表达纯化DNMT2及其H101Y突变体蛋白。同时,提取纯化了T7 DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶,并依靠这两种酶构建转录系统制备了人类t RNAGly。然后,以~3H标记的S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,对DNMT2及其H101Y突变体进行酶促动力学试验,通过检测转移到t RNA或DNA上的放射性,比较DNMT2及其H101Y突变体甲基化t RNA及DNA的活性。实验结果表明:野生型DNMT2及H101Y突变型DNMT2均有较强的甲基化t RNA的活性,DNMT2的H101Y突变体相对于野生型DNMT2,其甲基化t RNAGly的活性略微下降,而甲基化DNA的活性则升高,说明H101Y突变体可能在胃癌发生过程中,不仅参与t RNA甲基化,而且参与DNA表观遗传调控。