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研究背景
胃癌是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病机制目前仍未完全阐明。胃癌病因复杂，化学致癌物暴露被认为是导致胃癌最重要的因素之一。近年来非编码RNA在化学致癌物诱发肿瘤中的作用和机制逐渐成为研究的重点。lncRNA是非编码RNA家族中新的研究热点，越来越多证据表明lncRNA的异常表达与肿瘤发生和发展密切相关，但关于lncRNA在化学致癌物导致胃癌形成过程中的作用和机制的研究较少。在本次研究中，我们以MNNG(N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)诱导的胃粘膜恶变细胞GES-1-T和对照细胞GES-1-N为研究对象，通过lncRNA-seq高通量测序和RT-PCR方法发现，与对照细胞GES-1-N相比，LOC101927497在GES-1-T中显著下调。我们推测LOC101927497可能作为抑癌基因在MNNG诱导胃癌的发生发展中发挥着重要的作用，我们在GES-1-T和MKN28细胞株上通过一系列细胞体外功能试验结果发现，LOC101927497可以通过抑制细胞周期进程来抑制细胞的增殖，并能抑制细胞迁移能力。我们运用胞浆胞核定位实验发现该lncRNA主要分布于细胞浆，而RAP-RNA实验提示LOC101927497可能与miR-574-5p发生相互作用而参与调控肿瘤细胞的发生发展。总之，我们通过对MNNG诱导胃癌过程中lncRNA的筛选及功能机制的研究发现LOC101927497可能在MNNG诱导胃癌形成过程中起重要的调控作用。
研究目的
1.高通量筛选MNNG诱导胃粘膜上皮细胞恶性转化相关的lncRNA；
2.对其中差异明显的lncRNA的表达水平进行验证并探讨其在胃癌细胞中的表达水平；
3.进一步探讨关键lncRNA在MNNG诱导胃粘膜上皮细胞恶转中的作用及机制。
方法
1.高通量筛选差异表达lncRNA通过高通量测序检测GES-1-N与GES-1-T细胞中差异表达的lncRNA，以差异表达大于2倍或小于0.5倍、P值小于0.05的标准筛选差异表达的lncRNA。
2.差异lncRNA表达水平的验证用RT-PCR法验证GES-1-N和GES-1-T细胞中lncRNA的表达水平，同样方法在MKN-28和MGC-803两种胃癌细胞中检测lncRNA的表达水平。
3.RNA干扰用LipofectamineTM2000(Invitrogen)进行细胞转染，培养48h后提取总RNA用RT-PCR检测siRNA干扰效率。然后运用CCK-8细胞增殖、PI染色法和细胞划痕实验法检测下调lncRNA表达后GES-1-T和MKN-28细胞增殖、周期、迁移能力的改变。
4.过表达载体构建及稳定转染构建lncRNA过表达载体，检测过表达后效果，运用CCK-8细胞增殖、PI染色法和细胞划痕实验法检测上调lncRNA表达后GES-1-T和MKN-28细胞增殖、周期、迁移能力的改变。
5.CCK-8试验将pcDNA-LOC101927497和空载对照组，以及siRNA和阴形对照组转染至GES-1-T和MKN-28细胞，48h后，按CCK-8试剂盒说明书检测细胞的增殖能力。
6.流式细胞学实验将GES-1-T和MKN-28细胞接种至6孔板，培养24h后分别转染pcDNA-LOC101927497和空载对照组，以及siRNA和阴形对照组，48h后进行PI染色，用流式细胞仪检测不同细胞周期分布。
7.细胞凋亡检测将GES-1-T和MKN-28细胞接种至6孔板，培养24h后分别转染pcDNA-LOC101927497和空载对照组，以及siRNA和阴性对照组，48h后用AnnexinV-FITC试剂对细胞进行处理，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
8.细胞划痕试验GES-1-T和MKN-28细胞分别转染pcDNA-LOC101927497和pcDNA3.1空载对照组，以及siRNA和siRNA-NC对照组，24h后细胞生长至100%汇合。用吸头比着直尺在平板上垂直于横线划痕，PBS冲洗3次，常规培养,分别于0h和24h在显微镜下拍照并计算迁移率。
9.LncRNA胞浆胞核分布按AmbionPariskit试剂盒说明书进行操作，分别提取GES-1-T细胞核和细胞浆RNA，并通过RT-PCR检测LOC101927497在胞浆、胞核中的相对表达。
10.RAP-RNA实验通过生物信息学方法预测lncRNA的靶标microRNA，RAP-RNA实验进一步验证lncRNA与靶microRNA的相互作用。
11.统计分析所有试验至少重复3次，数据采用SPSS13.0进行统计分析，试验数据以x-±s表示。两组间比较采用双侧Student’st检验，3组以上比较用单因素方差分析，双侧检验以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1.细胞测序结果GES-1-T细胞中检测出lncRNA17626个，GES-1-N细胞中检测出17916个。GES-1-T细胞中较GES-1-N细胞中表达差异性显著的lncRNA共253个，其中表达上调的159个，下调的94个。
2.测序结果验证及在胃癌细胞株的表达从测序结果中选取差异较显著的7个lncRNA在GES-1-N和GES-1-T细胞中进行验证，发现LOC101927497在GES-1-T细胞中的表达水平显著低于在GES-1-N细胞中的表达，是GES-1-N细胞的(0.396±0.026)倍(P＜0.01)。LOC101927497在胃癌细胞株GES-1-T和MKN-28细胞中的表达水平也下调。
3.用siRNA干扰目的基因的表达分别用3对siRNA序列转染GES-1-T和MKN-28细胞，48h后发现三组siRNA的干扰效率均较好，与siRNA-NC组相比差别均有统计学意义(P＜0.01)。
4.lncRNA过表达载体构建以空载pcDNA3.1作为对照组，将pcDNA-LOC101927497和pcDNA3.1转染入GES-1-T和MKN-28细胞后进行效率检测，48小时后发现LOC101927497表达明显上调(P＜0.05)。接着用pcDNA-LOC101927497转染GES-1-T和MKN-28检测细胞功能变化。
5.敲低和过表达lncRNA后细胞增殖能力改变GES-1-T细胞和MKN-28细胞转染pcDNA-LOC101927497后，GES-1-T细胞和MKN-28细胞明显比空载对照组细胞生长慢。而GES-1-T和MKN-28细胞中转染siRNA，48h后检测细胞增殖能力，发现相对于转染siRNA-NC组的细胞增殖能力增强。
6.敲低和过表达LOC101927497后细胞周期改变GES-1-T和MKN-28细胞中转染pcDNA-LOC101927497后，GES-1-T出现了一定的G0/G1细胞生长阻滞，处于G0/G1期的GES-1-T细胞明显多于阴性对照组(52.57%，相对于阴性对照组45.22%)，而S期的GES-1-T细胞少于阴性对照组(45.45%，相对于阴性对照组50.48%)，MKN-28细胞也出现了相同的趋势；而转染siRNA-1和siRNA-2的GES-1-T和MKN-28细胞出现了相反的趋势。
7.敲低和过表达LOC101927497后细胞凋亡率检测将siRNA-1和siRNA-2转染入GES-1-T和MKN-28细胞，48小时后检测GES-1-T和MKN-28细胞的凋亡情况。发现与阴性对照组相比，GES-1-T细胞和MKN-28细胞的凋亡率并没有出现明显的变化。转染pcDNA-LOC101927497后GES-1-T细胞迁移能力增强，MKN-28细胞并没有出现明显变化。
8.细胞迁移能力改变细胞划痕实验发现转染siRNA-1和siRNA-2后GES-1-T细胞的迁移能力明显增强；而转染pcDNA-LOC101927497后GES-1-T细胞迁移能力减弱。
9.LOC101927497作用机制的初步探讨GES-1-T细胞浆细胞核RNA分离实验发现LOC101927497主要分布于细胞浆，生物信息学分析及RAP-RNA实验提示LOC101927497可能通过与miR-574-5p相互作用而发挥生物学功能。
结论
1.lncRNA-LOC101927497在MNNG诱导的人胃粘膜上皮恶性转化细胞GES-1-T及胃癌细胞MKN-28和MGC-803中表达下调。
2.lncRNA-LOC101927497表达水平能够影响GES-1-T和MKN-28细胞的增殖、周期进程和迁移。
3.lncRNA-LOC101927497主要分布于胞浆，其可能通过与miR-574-5p相互作用而发挥抑癌的作用。
胃癌是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病机制目前仍未完全阐明。胃癌病因复杂，化学致癌物暴露被认为是导致胃癌最重要的因素之一。近年来非编码RNA在化学致癌物诱发肿瘤中的作用和机制逐渐成为研究的重点。lncRNA是非编码RNA家族中新的研究热点，越来越多证据表明lncRNA的异常表达与肿瘤发生和发展密切相关，但关于lncRNA在化学致癌物导致胃癌形成过程中的作用和机制的研究较少。在本次研究中，我们以MNNG(N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)诱导的胃粘膜恶变细胞GES-1-T和对照细胞GES-1-N为研究对象，通过lncRNA-seq高通量测序和RT-PCR方法发现，与对照细胞GES-1-N相比，LOC101927497在GES-1-T中显著下调。我们推测LOC101927497可能作为抑癌基因在MNNG诱导胃癌的发生发展中发挥着重要的作用，我们在GES-1-T和MKN28细胞株上通过一系列细胞体外功能试验结果发现，LOC101927497可以通过抑制细胞周期进程来抑制细胞的增殖，并能抑制细胞迁移能力。我们运用胞浆胞核定位实验发现该lncRNA主要分布于细胞浆，而RAP-RNA实验提示LOC101927497可能与miR-574-5p发生相互作用而参与调控肿瘤细胞的发生发展。总之，我们通过对MNNG诱导胃癌过程中lncRNA的筛选及功能机制的研究发现LOC101927497可能在MNNG诱导胃癌形成过程中起重要的调控作用。
研究目的
1.高通量筛选MNNG诱导胃粘膜上皮细胞恶性转化相关的lncRNA；
2.对其中差异明显的lncRNA的表达水平进行验证并探讨其在胃癌细胞中的表达水平；
3.进一步探讨关键lncRNA在MNNG诱导胃粘膜上皮细胞恶转中的作用及机制。
方法
1.高通量筛选差异表达lncRNA通过高通量测序检测GES-1-N与GES-1-T细胞中差异表达的lncRNA，以差异表达大于2倍或小于0.5倍、P值小于0.05的标准筛选差异表达的lncRNA。
2.差异lncRNA表达水平的验证用RT-PCR法验证GES-1-N和GES-1-T细胞中lncRNA的表达水平，同样方法在MKN-28和MGC-803两种胃癌细胞中检测lncRNA的表达水平。
3.RNA干扰用LipofectamineTM2000(Invitrogen)进行细胞转染，培养48h后提取总RNA用RT-PCR检测siRNA干扰效率。然后运用CCK-8细胞增殖、PI染色法和细胞划痕实验法检测下调lncRNA表达后GES-1-T和MKN-28细胞增殖、周期、迁移能力的改变。
4.过表达载体构建及稳定转染构建lncRNA过表达载体，检测过表达后效果，运用CCK-8细胞增殖、PI染色法和细胞划痕实验法检测上调lncRNA表达后GES-1-T和MKN-28细胞增殖、周期、迁移能力的改变。
5.CCK-8试验将pcDNA-LOC101927497和空载对照组，以及siRNA和阴形对照组转染至GES-1-T和MKN-28细胞，48h后，按CCK-8试剂盒说明书检测细胞的增殖能力。
6.流式细胞学实验将GES-1-T和MKN-28细胞接种至6孔板，培养24h后分别转染pcDNA-LOC101927497和空载对照组，以及siRNA和阴形对照组，48h后进行PI染色，用流式细胞仪检测不同细胞周期分布。
7.细胞凋亡检测将GES-1-T和MKN-28细胞接种至6孔板，培养24h后分别转染pcDNA-LOC101927497和空载对照组，以及siRNA和阴性对照组，48h后用AnnexinV-FITC试剂对细胞进行处理，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
8.细胞划痕试验GES-1-T和MKN-28细胞分别转染pcDNA-LOC101927497和pcDNA3.1空载对照组，以及siRNA和siRNA-NC对照组，24h后细胞生长至100%汇合。用吸头比着直尺在平板上垂直于横线划痕，PBS冲洗3次，常规培养,分别于0h和24h在显微镜下拍照并计算迁移率。
9.LncRNA胞浆胞核分布按AmbionPariskit试剂盒说明书进行操作，分别提取GES-1-T细胞核和细胞浆RNA，并通过RT-PCR检测LOC101927497在胞浆、胞核中的相对表达。
10.RAP-RNA实验通过生物信息学方法预测lncRNA的靶标microRNA，RAP-RNA实验进一步验证lncRNA与靶microRNA的相互作用。
11.统计分析所有试验至少重复3次，数据采用SPSS13.0进行统计分析，试验数据以x-±s表示。两组间比较采用双侧Student’st检验，3组以上比较用单因素方差分析，双侧检验以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
1.细胞测序结果GES-1-T细胞中检测出lncRNA17626个，GES-1-N细胞中检测出17916个。GES-1-T细胞中较GES-1-N细胞中表达差异性显著的lncRNA共253个，其中表达上调的159个，下调的94个。
2.测序结果验证及在胃癌细胞株的表达从测序结果中选取差异较显著的7个lncRNA在GES-1-N和GES-1-T细胞中进行验证，发现LOC101927497在GES-1-T细胞中的表达水平显著低于在GES-1-N细胞中的表达，是GES-1-N细胞的(0.396±0.026)倍(P＜0.01)。LOC101927497在胃癌细胞株GES-1-T和MKN-28细胞中的表达水平也下调。
3.用siRNA干扰目的基因的表达分别用3对siRNA序列转染GES-1-T和MKN-28细胞，48h后发现三组siRNA的干扰效率均较好，与siRNA-NC组相比差别均有统计学意义(P＜0.01)。
4.lncRNA过表达载体构建以空载pcDNA3.1作为对照组，将pcDNA-LOC101927497和pcDNA3.1转染入GES-1-T和MKN-28细胞后进行效率检测，48小时后发现LOC101927497表达明显上调(P＜0.05)。接着用pcDNA-LOC101927497转染GES-1-T和MKN-28检测细胞功能变化。
5.敲低和过表达lncRNA后细胞增殖能力改变GES-1-T细胞和MKN-28细胞转染pcDNA-LOC101927497后，GES-1-T细胞和MKN-28细胞明显比空载对照组细胞生长慢。而GES-1-T和MKN-28细胞中转染siRNA，48h后检测细胞增殖能力，发现相对于转染siRNA-NC组的细胞增殖能力增强。
6.敲低和过表达LOC101927497后细胞周期改变GES-1-T和MKN-28细胞中转染pcDNA-LOC101927497后，GES-1-T出现了一定的G0/G1细胞生长阻滞，处于G0/G1期的GES-1-T细胞明显多于阴性对照组(52.57%，相对于阴性对照组45.22%)，而S期的GES-1-T细胞少于阴性对照组(45.45%，相对于阴性对照组50.48%)，MKN-28细胞也出现了相同的趋势；而转染siRNA-1和siRNA-2的GES-1-T和MKN-28细胞出现了相反的趋势。
7.敲低和过表达LOC101927497后细胞凋亡率检测将siRNA-1和siRNA-2转染入GES-1-T和MKN-28细胞，48小时后检测GES-1-T和MKN-28细胞的凋亡情况。发现与阴性对照组相比，GES-1-T细胞和MKN-28细胞的凋亡率并没有出现明显的变化。转染pcDNA-LOC101927497后GES-1-T细胞迁移能力增强，MKN-28细胞并没有出现明显变化。
8.细胞迁移能力改变细胞划痕实验发现转染siRNA-1和siRNA-2后GES-1-T细胞的迁移能力明显增强；而转染pcDNA-LOC101927497后GES-1-T细胞迁移能力减弱。
9.LOC101927497作用机制的初步探讨GES-1-T细胞浆细胞核RNA分离实验发现LOC101927497主要分布于细胞浆，生物信息学分析及RAP-RNA实验提示LOC101927497可能通过与miR-574-5p相互作用而发挥生物学功能。
结论
1.lncRNA-LOC101927497在MNNG诱导的人胃粘膜上皮恶性转化细胞GES-1-T及胃癌细胞MKN-28和MGC-803中表达下调。
2.lncRNA-LOC101927497表达水平能够影响GES-1-T和MKN-28细胞的增殖、周期进程和迁移。
3.lncRNA-LOC101927497主要分布于胞浆，其可能通过与miR-574-5p相互作用而发挥抑癌的作用。