目的:心血管事件(cardial vessel disease,CVD)是慢性肾脏病患者(chronic kidney disease,CKD)的常见并发症,且CVD又是CKD患者死亡的常见原因之一,而血管钙化(vascular calcification,VC)是CVD的高危因素。既往认为血管钙化是钙磷单纯沉积于血管壁的不可逆、被动过程,现在大量的研究表明血管钙化是多种因素参与的、与骨代谢异常相关的、可逆的、可调节的生物学过程。除年龄、糖尿病、高血压等传统因素外,钙磷代谢异常、氧化应激、继发性甲状旁腺功能亢进等非传统因素也对CKD患者血管钙化有着不可忽视的影响。终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)患者血管钙化主要发生于大、中脉的中膜,而动脉中膜主要成分之一是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)。VSMC转分化是血管中膜钙化的主要机制之一,即血管平滑肌细胞在各种因素的刺激下,从收缩表型向成骨/软骨样表型转化,同时合成并分泌Runx2、BMPs、Cbfα-1等蛋白分子调节血管钙化。越来越多的研究认为高磷诱导血管钙化的机制与成骨分化转录因子(runt-related transcription factor,Runx2)有密切关系。Runx2调节骨骼形成相关基因表达过程中发挥着重要作用,同时Runx2也受激素、细胞因子、转录因子及内环境变化的调节。Runx2通常不表达于血管组织,它的高表达与血管钙化发生和进展关系密切,且钙化愈严重,Runx2表达水平愈高,基础实验研究常将其作为血管钙化早期标志物。我科前期研究发现高磷能够促进慢性肾衰竭大鼠主动脉VSMC Runx2表达增加,进而发生表型转换。Byon等细胞实验表明,内源性敲除Runx2表达能够抑制TRAP阳性破骨细胞形成,RANKL表达和巨噬细胞迁移,进而减弱高脂饮食诱导的血管钙化,Gangahar等也证实MGP抑制钙化也是通过减低Runx2的表达,抑制其活性实现MGP钙化抑制作用。这些均说明调节Runx2表达可以抑制VSMC钙化。凋亡也是血管中膜发生钙化的主要机制之一。许多研究已经表明,钙化始于正在死亡的血管平滑肌细胞释放的膜结合基质小泡,即凋亡小体。Mc Nair采用电子显微镜观察透析和非透析患者中动脉发现,损伤/死亡的血管平滑肌细胞可以释放含纳米羟基磷灰石颗粒的基质小泡,推测这些基质小泡是钙化的起点,进一步研究发现透析可以加速基质小泡的释放从而加速透析患者血管钙化。Schoppet等通过in situ ligation分析发现,Monckeberg’s硬化患者动脉中膜存在凋亡,Sachiko等观察高磷培养的大鼠胸主动脉组织也发现凋亡增加。Kozaki等发现高磷能够加速血管平滑肌细胞凋亡并促进钙化,且这种作用能够被他汀类药物以剂量依赖性方式抑制。生长抑制特异基因-6(growth arrest-specific gene 6,Gas6)是维生素K依赖蛋白家族的一员,其配体为Axl,研究表明他汀类药物可以增加Gas6 m RNA的稳定性,而非增加其转录活性,从而激活Gas6-Axl信号通路,抑制人血管平滑肌细胞凋亡,进而减轻高磷诱导的钙化。而采用RNA干扰技术或消除Axl细胞外结构均可导致他汀类药物对高磷诱导血管钙化的抑制作用的消失。钙化抑制因子MGP(matrix gla protein,MGP)可以抑制钙磷沉积于血管壁而抑制血管钙化,进一步机制研究发现,于高磷培养的血管平滑肌细胞中上调MGP表达后,血管平滑肌细胞Caspase3及细胞因子表达减少、活性降低,细胞凋亡减弱,钙化减轻。Hyunsoo等研究发现,α-硫辛酸一方面可以通过稳定线粒体功能,抑制细胞色素c释放至胞浆激活Caspase3,减弱细胞凋亡而减轻血管钙化,另一方面也可以激活Gas6/Axl/Akt信号通路,增强细胞增殖能力而减轻血管钙化。总结前人的研究我们可以发现,血管平滑肌细胞凋亡是血管钙化发生的重要机制之一,Gas6/Axl/Akt信号通路在调节血管平滑肌细胞凋亡和钙化过程中发挥着重要作用。研究表明传统和非传统因素通过不同机制影响终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)患者血管钙化。Kirschbaum等在研究血液透析患者透析液碳酸氢盐浓度与钙离子浓度时发现,透后即刻血PH值明显升高,仅采用中心静脉导管透析的患者血清游离钙和总钙水平升高,采用自体动静脉内瘘或移植血管透析患者体内游离钙和总钙没有显著改变,且羟基磷灰石形成率均没有显著变化。但透析结束后两小时其发生迁移性钙化的风险较透前升高2.8倍,这表明血液PH值,亦或透析液PH可能与血液透析患者血管钙化风险密切相关。Pineda等学者对22只5/6肾切除CKD模型大鼠和10只非5/6肾切除大鼠研究发现,CKD模型大鼠血PH为7.57±0.03,非5/6肾切除大鼠血为7.36±0.1,且CKD模型大鼠主动脉钙化显著增加。进一步研究发现,血阴离子间隙(anion gap,AG)也与大鼠主动脉血管钙化和主动脉磷酸盐含量具有高度的相关性。目前,有关PH值及其波动对慢性肾脏病患者血管钙化的研究较少见。因此,本课题拟通过体内和体外实验研究PH值及其波动对CKD血管钙化的影响,探讨其在CKD血管钙化进展中的作用机制以及干预Gas6/AXLPI3K/AKT信号通路能否作为CKD血管钙化的治疗靶点。我们的研究结果有望进一步阐明CKD血管钙化的发病机制以及寻找CKD及ESRD患者治疗的新靶点和开发具有潜在治疗作用的靶向药物提供科学依据。方法:1终末期肾脏病患者冠脉钙化影响因素的研究选取2014年至2015年在河北医科大学第四医院血液净化中心行规律血液透析(3次/周)ESRD患者53例,根据冠脉钙化评分(coronary artery calcification score,CACs)分为钙化阴性组、钙化阳性组(轻度钙化组、中度钙化组、重度钙化组)。收集临床一般资料,采集一周首次透析前动脉血测定血常规、肝功能、电解质、血脂、C反应蛋白(CRP)、β2-微球蛋白(β2-MG)、游离甲状旁腺素(i PTH)、纤维蛋白原、铁蛋白等;并同次测定透析前、透析后动脉血PH值,计算△PH(PH透后-PH透前)。通过冠脉钙化评分与一般资料、上述血生化指标进行相关性、Logistic回归等统计学分析,探讨ESRD患者冠脉钙化的发生情况及其影响因素。2 PH及其波动对慢性肾衰竭大鼠主动脉血管钙化的影响及机制研究通过5/6肾切除术来构建大鼠慢性肾衰竭的模型,饲喂骨化三醇引起大鼠血管钙化的发生,腹腔注射分别注射NH4Cl、Na HCO3和隔天交替注射NH4Cl、Na HCO3构建大鼠慢性代谢性酸中毒、慢性代谢性碱中毒和酸碱波动的模型。将34只健康雄性SD大鼠,随机数字法将大鼠随机分成6组,即假手术组(n=6)、慢性肾衰竭组(n=5)、钙化组(n=5)、酸干预组(n=6)、碱干预组(n=6)和酸碱波动组(n=6)。30天之后,于大鼠的腹主动脉穿刺采血,血气分析测定动脉血p H,动脉血用肝素抗凝,离心后,分离血浆,-80℃冻存备用。取大鼠胸腹主动脉全长,用于组织学观察和钙含量测定。3胞外PH及其波动对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞表型转化及钙化的影响选取8~10周龄健康雄性SD大鼠6只,分别体外分离培养大鼠胸主动脉VSMCs,采用细胞形态学和免疫细胞化学方法鉴定。将VSMCs随机分为PH7.4组、PH7.4+磷组、PH6.8+磷组、PH7.7+磷组、PH6.8/7.7+磷组,刺激10天后对细胞进行钙含量检测;茜素红染色检测钙结节;刺激6天后进行碱性磷酸酶(ALP)活性检测,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Runt相关转录因子-2(Runx2)m RNA的表达。4胞外PH及其波动对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞凋亡的作用及机制研究选取8~10周龄健康雄性SD大鼠6只,体外分离培养大鼠胸主动脉VSMCs,采用免疫细胞化学方法鉴定。将VSMCs用随机抽样法分为PH7.4、PH6.8+磷、PH7.4+磷、PH7.7+磷、PH6.8/7.7+磷共5组。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Bcl2 m RNA、Bax m RNA、caspase3m RNA表达,计算Bcl2/Bax。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。5胞外酸性刺激对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞凋亡的作用及机制研究选取8~10周龄健康雄性SD大鼠6只,体外分离培养大鼠胸主动脉VSMCs,采用免疫细胞化学方法鉴定。将VSMCs用随机抽样法分为PH7.4、PH6.8+P、PH7.4+P、PH6.8+P+LY294002共4组。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Gas6 m RNA、Axl m RNA、caspase3 m RNA和Akt m RNA表达,Western Blot法检测Caspase3、cleaved-Caspase3、t-Akt和p-Akt的表达。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:1终末期肾脏病患者冠脉钙化影响因素的研究(1)入组ESRD患者53例,按照其冠状动脉钙化的程度分成四组,其中年龄越大、透龄越长、血磷越高,钙化程度越强,而舒张压、白蛋白、△PH越小,钙化程度越重。与阴性组比较,上述指标重度钙化组均有统计学差异(P<0.05),其中透龄中度钙化组与阴性组比较也有统计学差异(P<0.05)。(2)ESRD患者冠状动脉钙化积分与年龄(r=0.269,P<0.05)、透龄(r=0.341,P<0.01)、血钙水平(r=0.358,P<0.01)、血磷水平(r=0.186,P<0.05)及PH透前(r=0.275,P<0.05)呈正相关,与白蛋白(r=-0.192,P<0.05)、△PH(r=-0.302,P<0.05)呈负相关;对其钙化评分取对数值后,仍有如上的相关关系。(3)Logistic回归分析结果发现:年龄、△PH、透龄和血磷水平是患者发生冠脉钙化的独立危险因素。2酸、碱性环境及其波动对慢性肾衰竭大鼠主动脉血管钙化的影响及机制研究(1)酸性环境对慢性肾衰竭大鼠主动脉钙化的影响:与假手术组(n=6)大鼠相比,慢性肾衰竭组(n=5)、钙化组(n=5)及酸干预组(n=6)大鼠血肌酐和尿素氮水平均显著增高(P<0.05);与假手术组、慢性肾衰竭组(n=5)、钙化组(n=6)分别比较,酸干预组大鼠动脉血p H和[HCO3-]水平均下降(P<0.05)。von Kossa染色结果显示:钙化组大鼠主动脉发生明显钙化,但假手术组、慢性肾衰竭组和酸干预大鼠主动脉均未发生主动脉钙化。钙含量结果显示,与假手术组相比较,慢性肾衰竭组大鼠主动脉钙含量无明显增高(2.46±1.23vs2.44±0.56,P>0.05);钙化组大鼠主动脉钙含量较假手术组和慢性肾衰竭组大鼠均显著增高(9.73±1.83vs2.44±0.56,9.73±1.83vs2.46±1.23,P<0.05);与钙化组相比,酸干预大鼠主动脉钙含量明显降低(9.73±1.83vs5.27±2.12,P<0.05)。免疫组化结果显示,与假手术组相比较,慢性肾衰竭组大鼠主动脉Runx2、Caspase3免疫组化评分无明显差异(2.95±1.10vs2.25±0.82;2.72±0.86vs1.46±1.22,P>0.05);钙化组大鼠主动脉Runx2、Caspase3免疫组化评分较假手术组和慢性肾衰竭组大鼠均显著增高(6.16±1.59vs2.25±0.82,6.16±1.59vs2.95±1.10;6.62±1.31vs1.46±1.22,6.62±1.31vs2.72±0.86,P<0.05);与钙化组相比,酸干预大鼠主动脉Runx2、Caspase3免疫组化评分显著降低(6.16±1.59vs4.11±0.92;6.62±1.31vs3.60±1.43,P<0.05)。(2)碱性环境对慢性肾衰竭大鼠主动脉钙化的影响:与假手术组、慢性肾衰竭组、钙化组分别比较,碱干预组大鼠动脉血PH水平升高(P<0.05),假手术组、慢性肾衰组、钙化组之间差异无统计学意义。与假手术组大鼠相比,慢性肾衰竭组、钙化组及碱干预组大鼠血浆肌酐和尿素氮水平均显著增高(P<0.05)。Von Kossa染色结果显示:与假手术组、慢性肾衰竭组相比,钙化组、碱干预组大鼠主动脉钙化明显。钙含量结果显示,碱干预组大鼠主动脉钙含量较假手术组和慢性肾衰竭组大鼠均显著增高(13.86±3.16vs2.44±0.56,13.86±3.16vs2.46±1.23,P<0.05);与钙化组相比,碱干预大鼠主动脉钙含量明显升高(13.86±3.16vs9.73±1.83,P<0.05)。免疫组化结果显示,碱干预组大鼠主动脉Runx2、Caspase3免疫组化评分较假手术组和慢性肾衰竭组大鼠均显著增高(8.96±1.36vs2.25±0.82,8.96±1.36vs2.95±1.10;8.01±0.74vs1.46±1.22,8.01±0.74vs2.72±0.86,P<0.05);与钙化组相比,碱干预大鼠主动脉Runx2、Caspase3免疫组化评分显著升高(8.96±1.36vs6.16±1.59;8.01±0.74vs6.62±1.31,P<0.05)。(3)酸碱波动对慢性肾衰竭大鼠主动脉钙化的影响:Von Kossa染色结果显示:与酸干预组相比,波动组大鼠主动脉钙化明显增加;与碱干预组相比,波动组大鼠主动脉钙化则显著降低。钙含量结果显示,与酸干预组相比,波动组大鼠主动脉钙含量明显增加(8.59±1.84vs5.27±2.12,P<0.05);与碱干预组相比,波动组大鼠主动脉钙含量则显著降低(8.59±1.84vs13.86±3.16,P<0.05)。免疫组化结果显示,与酸干预组相比,波动组大鼠主动脉Runx2、Caspase3免疫组化评分明显升高(6.74±1.22vs4.11±0.92;6.41±1.15vs3.60±1.43,P<0.05);与碱干预组相比,波动组大鼠主动脉Runx2、Caspase3免疫组化评分则显著降低(6.74±1.22vs8.96±1.36;6.41±1.15vs8.01±0.74,P<0.05)。3胞外PH及其波动对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞表型转化及钙化的影响(1)不同PH值胞外刺激10天后5组大鼠VSMCs钙含量比较,PH6.8+磷组低于PH7.7+磷组(P<0.05)和PH6.8/7.7+磷组(P<0.05);PH6.8/7.7+磷组低于PH7.7+磷组(P<0.05)。茜素红染色结果与钙含量测定结果一致。(2)不同PH值胞外刺激6天后5组大鼠VSMCs ALP活性比较,PH6.8+磷组低于PH7.7+磷(P<0.05)和PH6.8/7.7+磷组(P<0.05);PH6.8/7.7+磷组低于PH7.7+磷组(P<0.05)。(3)不同PH值胞外刺激6天后5组大鼠VSMCs Runx2 m RNA表达量比较,PH6.8+磷组低于PH7.7+磷(P<0.05)和PH6.8/7.7+磷组(P<0.05);PH6.8/7.7+磷组低于PH7.7+磷组(P<0.05)。4胞外PH及其波动对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞凋亡的作用及机制研究PH6.8+磷组细胞凋亡率及Caspase3 m RNA均低于PH7.7+磷组(P<0.05)和PH6.8/7.7+磷组(P<0.05);PH6.8+磷组Bcl2/Bax水平高于PH7.7+磷组(P<0.05)和PH6.8/7.7+磷组(P<0.05)5胞外酸性刺激对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞凋亡的作用及机制研究(1)细胞外酸性环境对大鼠VSMCs刺激10天后进行茜素红染色和钙含量测定。与PH7.4组相比,PH7.4+P组钙含量显著增加(P<0.05),PH6.8+P组钙含量也显著高于PH7.4组(P<0.05)。随着PH减低,PH6.8+P组钙含量明显低于PH7.4+P组(P<0.05)。茜素红染色结果与钙含量测定结果一致。(2)VSMCs细胞凋亡的检测使用FACSort血细胞计数器(美国,纽约,FACSCA)。结果表明,细胞主要集中在D3、D4、B3、B4、C3、C4。PH 7.4+P组大鼠VSMCs凋亡率显著高于PH7.4组(P<0.05),约为其3倍。PH6.8+P组大鼠VSMCs凋亡率约为PH7.4+P组凋亡率的60%,其差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)PH7.4组、PH7.4+P组、PH6.8+P组Gas6表达两两之间均无明显差异(均P>0.05)。PH7.4+P组、PH6.8+P组Axl m RNA的表达均显著低于PH7.4组(P<0.05)。然而与PH7.4+P组相比较,随着PH减低,PH6.8+P组Axl m RNA的表达显著升高(P<0.05)。我们同时采用Western Blot法对三组Axl蛋白表达情况进行了检测(Fig.4-3C)。Axl蛋白表达情况与m RNA表达情况一致,与PH7.4组相比较,PH7.4+P组、PH6.8+P组Axl蛋白表达量分别减少了45%和66%,且PH6.8+P组Axl蛋白表达量是PH7.4+P组的1.5倍。(4)PH6.8+P+LY294002组较PH6.8+P组钙含量明显下降(P<0.05),但仍显著低于PH7.4+P组钙含量。三组VSMCs凋亡率与钙含量变化结果一致。PH6.8+P+LY294002组和PH6.8+P组凋亡率显著高于PH7.4+P组(P<0.05)。Western Blot结果显示,PH6.8+P+LY294002组和PH6.8+P组Caspase3表达明显增加而Akt表达明显减少(P<0.05)。结论:1 ESRD患者冠脉钙化受多种因素的影响,年龄、透龄、血磷、△PH是患者发生冠脉钙化的独立危险因素,而透前PH在△PH对冠脉钙化的影响中起着重要作用。2酸性环境能够抑制慢性肾衰竭大鼠主动脉钙化,而碱性环境及酸碱波动能够促进慢性肾衰竭大鼠主动脉钙化。其机制可能是通过调控Runx2和Caspase3表达进而干预血管平滑肌细胞表型转化和凋亡实现对血管钙化的影响。3胞外酸性环境能够抑制高磷诱导的大鼠VSMCs钙化,而胞外碱性环境及酸碱波动促进其钙化,其机制可能是通过升高或降低了Runx2及ALP的表达而促进或抑制了VSMCs成骨成软骨样表型转化而实现的。4胞外酸性环境能够抑制高磷诱导的大鼠VSMCs凋亡,而胞外碱性环境及酸碱波动促进其凋亡。其机制可能是通过影响了Bcl-2、Bax及Caspase3的表达而导致了其凋亡5胞外酸性刺激可以抑制高磷诱导的血管平滑细胞钙化,其机制可能是Gas6/Axl-PI3K/Akt信号通路在胞外酸性刺激抑制大鼠血管平滑肌细胞钙化中起着一定作用。