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目的:研究肿瘤细胞内MSH2基因表达、端粒酶及NADPH氧化酶对辐射敏感性的影响并探讨其作用机制。研究内容包括四方面:第一,X射线及重离子辐照对人肿瘤细胞MSH2表达及生物学效应的影响;第二,抑制MSH2表达提高人肿瘤细胞碳离子辐射敏感性;第三,MSH2下游基因hTERT对人肿瘤细胞重离子辐射敏感性的影响;第四,内源性活性氧参与调节肿瘤细胞重离子辐射敏感性。材料和方法:碳离子束和X射线辐照人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞,应用MTT实验分别对辐照后细胞进行细胞毒性检测,采用克隆形成实验检测细胞存活率,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,RT-PCR、Western Blotting、激光共聚焦显微镜检测MSH2、端粒酶各亚基、PGC-1a、NOX家族蛋白的表达;合成特异性MSH2-siRNA寡核苷酸,转染HepG2细胞,抑制MSH2的表达,观察下调MSH2基因后肝癌HepG2细胞辐射敏感性的变化;用端粒酶抑制剂MST-312处理人乳腺癌MCF-7细胞,应用相应试剂盒检测端粒酶活性,线粒体总量、线粒体DNA拷贝数量和线粒体膜电位及细胞衰老;利用NADPH氧化酶抑制剂diphenyliodonium(DPI)处理人肝癌HepG2细胞,应用荧光探针DCFH-DA检测活性氧水平,激光共聚焦显微镜观察p47phox亚基与NOX2在细胞内的分布及数量,分析重离子辐照后NADPH氧化酶在辐射敏感性中的作用。结果:第一,X射线和碳离子辐照人肝癌HepG2细胞后,随辐射剂量增加存活率逐渐降低,存在剂量依赖性,并且高LET的碳离子明显比X射线对人肝癌HepG2细胞的杀伤能力强。经重离子辐照后,2 h便出现MSH2表达,随着时间延长,MSH2表达逐渐增加,至6 h时,这种修复作用似接近高峰,随着时间的推移,MSH2的表达逐渐减小,在12 h时仍有表达,但24 h几乎看不到表达,推测其行使DNA损伤修复功能的高峰可能在6 h-12 h。第二,转染MSH2 siRNA后,MSH2表达下降,人肝癌HepG2细胞对重离子辐射敏感性提高,并出现G2/M期阻滞,随后sub-G1明显升高;随剂量和时间延长,P53蛋白表达也逐渐增高。第三,人乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性在照射4 Gy、10 Gy受到抑制,比较照射前及照射后hTERT mRNA在辐照后表达下降,这一结果进一步由real-time PCR在mRNA水平和Western Blotting在蛋白水平证实,差异有统计学意义。2μM hTERT抑制剂联合2-4 Gy射线处理MCF-7后,克隆存活率与单独辐照组明显减少。在2 Gy照射时克隆存活率为46%,经MST-312处理后,克隆存活率进一步减少到17%。单独用重离子辐照,可以使细胞在辐照24 h后出现G2/M期阻滞,48 h后有所下降,但仍高于对照组。随着加入MST-312,G2/M向G1/S转换;重离子辐射能够显著影响端粒酶活性,进而抑制MCF-7线粒体的正常功能。并通过降低PGC-1a表达介导MCF-7的老化。第四,4 Gy重离子辐照HepG2细胞12 h后,细胞内活性氧明显增多,当应用DPI后,活性氧明显减少。4 Gy重离子辐照HepG2细胞后,p47phox亚基明显增多,给予抑制剂后p47phox亚单位明显减少,并且NOX2的变化与p47phox亚单位一致。NOX家族的大部分蛋白,在重离子辐照1 h后明显上升,并且存在剂量依赖性。NOX2、NOX3表达在4 Gy辐照后比1 Gy辐照后下降的多,说明在低剂量重离子辐射情况下也主要由NOX2,NOX3发挥功能。结论:第一,MSH2在射线损伤修复中起重要作用,下调MSH2的表达可以提高辐射敏感性,这一过程中p53信号通路起重要作用。第二,端粒酶抑制剂MST 312可以增强人乳腺癌细胞MCF-7对重离子的辐射敏感性。第三,碳离子辐照可通过激活NADPH氧化酶产生ROS,从而增强重离子的辐射敏感性。