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茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze.)属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物。中国是茶树的原产地,是世界上最早发现和利用茶树的国家,经历了从药用到饮用的发展过程。目前,茶叶已发展成为全球最重要的天然无酒精饮料,全球有50多个国家和地区种茶,2014年年产茶超过500万吨。中国有20个省(自治区、市)产茶,茶园面积和产量均为世界第一位。按照加工方法的不同,一般将茶叶分为不发酵茶(如绿茶)、轻发酵茶(如白茶)、半发酵茶(如乌龙茶)、全发酵茶(如红茶)和后发酵茶(如黑茶)等。不同加工工艺的茶叶具有不同的品质特征。乌龙茶是具有鲜明香味特色的茶叶类别,然而其特有香气的形成机制尚不明确。传统发酵茶香气形成假说认为,茶叶细胞中的香气物质主要以香气糖苷体的形式储存在细胞液泡中,在茶叶加工制作过程中,糖苷体受各种胁迫作用,与糖苷水解酶接触并发生水解反应,进而释放出各种香气化合物。本课题以乌龙茶为研究对象,利用GC-MS对日光萎凋、室内萎凋、做青和杀青等一系列乌龙茶加工工序中香气物质和香气糖苷体的含量变化进行监测,同时检测茶叶中最主要的糖苷水解酶β-樱草糖苷酶的酶活、基因表达水平和亚细胞定位,此外利用透射电镜观察加工过程对茶叶细胞结构的影响,为验证传统发酵茶香气形成假说在乌龙茶上的适用性提供科学依据;另一方面,通过GC-MS/O技术鉴定出乌龙茶的主要贡献香气化合物,并对其相关的代谢路径进行探究,为深入研究乌龙茶香气的代谢合成机制提供科学依据。本研究的主要结论如下: (1)在乌龙茶加工过程中,香气糖苷体没有减少,来自于糖苷体水解产生的游离香气物质也没有增加,并且糖苷水解酶在蛋白和基因水平均不存在激活现象。亚细胞定位和细胞结构观察显示,β-樱草糖苷酶(茶叶中最主要的糖苷水解酶)位于叶片细胞壁上,而叶片细胞在乌龙茶加工过程中不存在破碎现象,且细胞壁依然完整。当做青过程中的叶片被人工揉碎之后,糖苷体含量也随之明显减少。由此表明,在乌龙茶加工过程中,不存在糖苷水解酶和香气糖苷体接触并发生水解反应。乌龙茶香气的形成并非来自于香气糖苷体的酶水解。 (2)利用AEDA和GC-MS/O技术来对乌龙茶特征性香气物质进行鉴定。结果显示,在乌龙茶产品中,49种物质的FD值位于41-47之间,其中11种物质的FD值等于或大于44,包括呋喃酮、茉莉内酯、丁位癸内酯、芳樟醇、香兰素、β-紫罗兰酮、3-甲基壬烷-2,4-二酮、β-大马士酮、吲哚和两种未鉴定的化合物。 (3)吲哚(Indole)、茉莉内酯(Jasmine lactone)和反式橙花叔醇(trans-Nerolidol)是乌龙茶加工过程中的主要特征性花香物质,在做青过程中这三种香气物质含量呈显著性增加。在对做青过程中的茶叶进行细胞完全破碎处理后,这三种香气物质的含量呈显著性降低,这说明类似于红茶揉捻过程的机械损伤并没有促进这三种香气物质的积累,这与红茶中含有较低含量的这些特征性花香物质的结果一致。发现这些特征性花香成分形成的原因主要是合成的相关基因和路径受乌龙茶做青过程中的机械损伤胁迫被激活,包括吲哚来自于以氨茴酸为前体的代谢途径,且该路径的色氨酸合酶-β-亚基(TSB)基因表达水平被上调;茉莉内酯来自于亚麻酸代谢途径,且上游的脂肪氧化酶(LOX)基因表达水平被上调;反式橙花叔醇来自于法尼基焦磷酸代谢途径,且上游的萜类合成酶(TPS)基因被激活。 本研究首次揭示了乌龙茶香气形成的本质,并阐明了半发酵茶(乌龙茶)与发酵茶(红茶)香气形成机制的本质差别;发现加工过程中不同机械损伤模式所引起的细胞壁破碎,是影响茶叶特异花香成分形成的重要因子。研究结果将有助于提高我们对茶叶加工过程中香气形成机理的认识,并为今后改良茶叶香气的加工新技术的开发提供一定的理论基础。