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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重影响全球养猪业的重要病原。PRRSV的非结构蛋白(Nsps)在病毒复制、免疫调节以及致病机制中具有重要的生物学功能,分析Nsp与宿土细胞蛋白之间的相互作用及其调控病毒复制和参与病毒致病性对于阐明PRRSV的致病机制具有重要的理论意义。本研究确证了PRRSV Nsp9与宿主细胞蛋白DDX5、Nsp2与DDX3X之间的相互作用,并探讨了其分子机制及其生物学意义。采用免疫共沉淀(Co-IP)技术证实了Nsp9与DDX5存在相互作用,并确定了相互作用的区域为Nsp9C端的RdRp结构域和DDX5N嵩的DEXDc与HELICc结构域。激光共聚焦分析显示,在Nsp9和DDX5真核表达质粒转染的情况下,两者主要共定位于细胞质及细胞核的周围；而PRRSV感染能诱导DDX5从细胞核转移到细胞质,并与Nsp9共定位。在MARC-145细胞中,采用RNA干扰和慢病毒转导技术证实DDX5的表达有利于PRRSV的复制。以上研究结果提示,Nsp9与DDX5相互作用可促进病毒白身的复制,为理解PRRSV的复制调控机制提供了新的视角。利用免疫共沉淀(Co-IP)技术证实了Nsp2与DDX3X之间的相互作用,并确定与DDX3X相互作用j的区域为Nsp2N端的半胱氨酸蛋白酶结构域。激光共聚焦分析显示,在PRRSV感染及真核质粒共同转染细胞的情况下,Nsp2均能与DDX3X在细胞质中共定位。利用免疫共沉淀技术证实了DDX3X与MAVS之间的相互作用,并确定两者互作的区域为DDX3X C端的HELFCc区域与MAVSN端的CARD区域。激光共聚焦分析显示,DDX3X可与MAVS在细胞质中共定位。双荧光素酶报告试验表明,DDX3X能激活并以剂量依赖的形式促进MAVS激活IFN-β启动子；而Nsp2能抑制IFN-β及IRF3启动子活性,并影响IRF3的磷酸化水平及核定位情况。进一步研究发现,在PRRSV感染及Nsp2真核质粒转染细胞的情况下,Nsp2均能抑制MAVS介导的IFN-β启动子活性及MAVS介导的IRF3磷酸化水平。免疫共沉淀技术和、Western blotting分析结果表明,PRRSV感染及Nsp2真核质粒转染细胞后均能影响细胞内DDX3X的表达水平及DDX3X与MAVS之间的相互作用。同时,通过RNA干扰试验和慢病毒转导试验证实DDX3X的表达不利于PRRSV在MARC-145细胞中的复制。以上结果提示,Nsp2能够通过与DDX3X相互作用减弱DDX3X与MAVS之间的互作,影响DDX3X对MAVS所介导的IRF3磷酸化水平及IRF3启动子活性,抑制IFN-β启动子活性,阻碍IFN-β的产生,拮抗DDX3X的抗病毒作用,从而有利于病毒的复制。综上所述,我们的研究揭示了PRRSV Nsp9与DDX5、Nsp2与DDX3X之间相互作用的机制及其对PRRSV复制的影响,为进一步理解PRRSV复制调控和致病的分子机制提供了科学依据。