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研究背景和目的:由噪声、药物、遗传、感染、老龄化及全身性疾病导致的听力损害严重影响着人们的生活质量和人际交流,费用高昂的耳蜗移植和安装助听器只能部分的恢复听力,并且给个人和社会带来巨大的医疗负担,因此听力保护是当今社会面临的重要问题。大量实验结果显示,听觉功能与多种基因调控的离子通道功能密切相关。对小鼠耳蜗发育过程中瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)基因定量分析发现Trpm7基因在耳蜗具有较高的表达,但该通道在耳蜗的定位及其功能研究尚未见报道。TRPM7通道广泛表达于哺乳动物的多种组织器官,与胚胎发育、细胞生存和增殖、神经递质释放以及神经细胞的死亡都有着密切的关系,成为近年来离子通道领域研究的热点。本实验旨在研究:1.TRPM7通道在小鼠出生后耳蜗发育的不同时期、不同部位表达水平和定位的研究;2.TRPM7通道在螺旋神经节神经元(Spiral ganglion neuron,SGN)细胞上的作用研究;3.模拟噪声后SGN形态和存活状态的变化与TRPM7通道功能的关系。研究结果将有利于全面的认识TRPM7通道在耳蜗中的细胞分布和出生后耳蜗发育过程中的变化以及对SG细胞功能及存活的影响,为临床保护和恢复耳蜗功能提供新的实验依据。 研究内容和方法:1.以出生后不同发育时期(P0、P7、P15、P21)小鼠的耳蜗为研究对象,通过分子生物学方法和免疫组织化学技术确定Trpm7基因和蛋白在耳蜗的表达变化以及该通道的组织分布情况;2.以培养的原代SGN细胞为研究对象,利用TRPM7通道阻断剂2-APB,观察TRPM7通道对SGN生理作用,并观察TRPM7通道是否会通过介导Ca2+超载引起SGN的损伤,将揭示TRPM7通道介导的Ca2+超载与SGN的损伤的关系;3.通过培养基中加入过量谷氨酸,模拟噪声引起的毛细胞过度兴奋,观察SGN损伤的程度和细胞的死亡率,探讨噪声导致的SGN损伤与TRPM7通道功能的关系。 结果:1.Trpm7mRNA和蛋白在P0表达水平最高,明显高于出生后其它时间点(p<0.05),之后,表达水平保持相对稳定状态;TRPM7通道主要表达于耳蜗毛细胞(HC)、血管纹(SV)和螺旋神经节(SG)三个部位;荧光灰度值分析结果显示,TRPM7通道在HC内的表达在P0最高,SV内的表达在P15最高,而SG内的表达在P21最高。2.急性分离培养的原代SG细胞中,SGN达到85%以上。分离后的SGN可以连续培养7天左右而保持良好的状态,这为我们的实验提供了充裕的时间窗口。利用Indo-1检测细胞内Ca2+浓度,低浓度Ca2+(0.3mM)培养基处理后,SGN内游离Ca2+浓度明显高于对照组(p<0.01),给予TRPM7通道阻断剂2-APB预处理后,低Ca2+培养基导致的SGN细胞内游离Ca2+浓度升高的程度明显下降(p<0.01)。除此之外,对2-APB浓度效应进行观察时发现,当培养基中2-APB达到一定浓度时(200μ M),培养一定时间后(4小时),正常培养的SGN纤维长度变短(p<0.01)。3.培养基中加入过量谷氨酸,模拟噪声引起的毛细胞兴奋释放过量谷氨酸的现象,实验结果显示,培养基中谷氨酸浓度升高,培养72小时,SGN纤维长度与对照组比较明显变短(p<0.01),同时发现SGN死亡率升高(p<0.01),给予2-APB预处理,可以减轻SGN的损伤程度(p<0.05)和细胞的死亡率(p<0.01)。 结论:根据以上结果,我们可以得到以下结论:1.TRPM7通道在不同发育时期小鼠耳蜗的HC、SGN和SV都有着特异的组织定位,并且表达水平变化与这些组织的形态和功能发育相关,这提示TRPM7通道可能在耳蜗形态和功能的发育以及听觉功能的维持中起着重要的作用。2.细胞外一过性低钙可以导致细胞内游离Ca2+浓度升高,表明SGN对Ca2+通透性升高,这与脑神经元Ca2+超载的现象极其相似,而2-APB的预处理可以降低细胞内Ca2+浓度升高的程度,证明了TRPM7通道参与了一过性低钙导致的SGN内游离Ca2+浓度升高的过程。这些结果提示,SGN的死亡可能与Ca2+超载和TRPM7通道的功能相关。3.培养基中谷氨酸浓度升高可以导致SGN继发性损伤甚至死亡,抑制TRPM7通道的功能,可以减轻谷氨酸对SGN损伤的程度和死亡率,这一结果与抑制TRPM7通道表达可以保护脑缺血/再灌注后的海马神经元迟发性死亡一致。因此推测,噪声导致的细胞外谷氨酸浓度升高,激活突触后膜NMDA受体,介导Ca2+进入SGN细胞,导致细胞内过氧化产物含量升高,同时细胞外Ca2+浓度降低,都成为激活TRPM7通道的刺激因素,激活的TRPM7通道进一步介导Ca2+进入细胞,诱发Ca2+超载,最终导致了SGN细胞的损伤和死亡。这表明TRPM7通道可能在噪声导致的SGN损伤中发挥着重要的作用,这为探讨噪声性SGN损伤的机制奠定了基础,也为听觉功能保护提供有力的实验支持。TRPM7通道在HC和SV的分布,也为进一步探索TRPM7通道在耳蜗的功能提供直接的实验依据。