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背景:多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)常见于育龄期妇女,是一种常见的、以内分泌紊乱为表现的妇科疾病,其大致归属于中医学的“月经后期”、“闭经”、“崩漏”、“不孕”等病证范畴。PCOS不仅影响到了患者的生殖健康和生存质量,紊乱的内分泌状态及代谢环境使此类患者的远期并发症风险增加,现医学领域研究的热点。中医药在治疗本病的远期效果优于西医治疗,目前中医药治疗多囊卵巢综合征主要根据中医辨证与辨病两者相结合的方式分型论治,目前已取得了较好的疗效。加减龙胆泻肝汤为广州中医药大学第一附属医院的中医妇科专家张玉珍教授多年经验总结的临床良方,是治疗肝经郁火型多囊卵巢综合征的有效方剂。故本研究以加减龙胆泻肝汤治疗PCOS为基础,围绕激素水平、炎症水平的改变以及初步探讨信号通路分子机制,开展本次研究,有利于揭示中医药方剂和诊疗方法对治疗多囊卵巢综合征的价值优势,以及促进加减龙胆泻肝汤的现代药理作用和深层机制研究。目的:1.临床研究:从临床上收集PCOS患者的一般资料,分析PCOS患者中医证型分布情况、西医表型的分布规律及证型与表型之间的相关性,检测患者性激素水平、糖代谢指标和慢性炎性因子;并分析患者性激素水平、糖代谢指标和慢性炎性因子与PCOS中医证型、西医表型之间的关联性,初步明确该疾病分型异同的关键点、治疗的主要和次要参考指标、患者特异性分析等。为临床治疗PCOS方案、疾病的分型分析、病症起因与生理症状等提供依据,加深临床工作者对该疾病的认知程度,以期指导临床辨证用药。2.实验研究:通过poresky法复制PCOS模型大鼠,观察加减龙胆泻肝汤对PCOS模型大鼠的药效作用及其作用影响下的机理。通过研究明确加减龙胆泻肝汤治疗PCOS的效果,及其在证实炎症学说基础上的炎症水平下降,糖代谢异常的恢复和激素水平的调节作用,以及对相关炎症JAK2/STAT3信号通路的调控作用。本研究有利于促进龙胆泻肝汤在“肝经郁火型”疾病应用和开发经典名方剂的现代药物价值。方法:1.临床资料采集和分析方法:采集对象:本研究共纳入2组人群共计136例,其中PCOS组102例,对照组为34例身体健康月经规律的女性。病例观察:一般情况:姓名、联系方式、年龄、婚育史、月经史、孕产史、家族史等及患者就诊的情况。体格检查:身高、体重、腰围、臀围;计算BMI=体重(kg)/身高2(m2)和腰臀比(WHR)。结合舌脉,确定其中医证型。性激素水平:化学发光法检测血清中促卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、睾酮(T)的水平,ELASA法检测血清Leptin、kisspeptin含量。血清生化测:自动生化仪测定空腹血糖(FPG)、放射免疫法测定空腹胰岛素(FINS)的水平。炎症因子水平:ELASA法检测血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10的测定。运用数理统计方法,对PCOS患者进行表型归类,辨证分析,观察PCOS的性激素水平、糖代谢及血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10,并进行相关性分析。2.采用胰岛素(INS)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)法复制大鼠PCOS模型;实验设对照、模型、达英-35(0.21 g/kg)及龙胆泻肝汤高(29.6 g/kg)/低剂量组(7.4 g/kg),连续灌胃给药14d;分析加减龙胆泻肝汤治疗的卵巢重量、体积大小及动物体重变化;比较各组LH、FSH、睾酮的性激素水平、空腹血糖、空腹胰岛素及IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 炎症因子差异;WB 分析各组卵巢 JAK2、STAT3、p-STAT3和IL-6的表达量。结果:1.临床研究结果分析:(1)分布特点:本研究共纳入102例PCOS患者,表型分布规律:经典型31例(占30%),高雄无排卵型12例(12%),高雄有排卵型8例(占8%),非高雄型有51例(占50%)。证型分布规律:肾虚型27例(占26.5%),肝经郁火型38例(占37.3%),痰湿阻滞型18例(占17.6%),气滞血瘀型19例(占18.6%)。(2)性激素水平:各表型相比:经典型患者的LH、T水平值及LH/FSH比值最高,与非高雄型差异有统计学意义(P<0.05),T水平由大到小依次为经典型>高雄有排型>高雄无排型>非高雄型,且经典型T水平与非高雄型、高雄无排型差异有统计学意义(P<0.05)。各证型相比:肝经郁火型的LH、T水平值及LH/FSH 比值最高,T水平由高到低依次为:肝经郁火型>脾虚痰湿型>气滞血瘀型>肾虚型,且肝经郁火型T水平与其余证型均有统计学差异(P<0.05)。(3)糖代谢特点:各表型相比:所有PCOS患者的空腹胰岛素均比正常组高(P<0.05),其患者组间差异无统计意义(P>0.05)。所有PCOS患者的HOMA-IR均较正常组高(P<0.05),但患者组间比无明显差异(P>0.05)。各证型相比:HOMA-IR高到低依次为:脾虚痰湿型>肝经郁火型>气滞血瘀型>肾虚型,且与肾虚型比较,脾虚痰湿型的HOMA-IR差异有统计学意义(P<0.05)。(4)血清Leptin、kisspeptin水平:各表型相比:PCOS患者血清Leptin、kisspeptin水平均高于正常组,非高雄型和对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),各证型比较:脾虚痰湿型的Leptin最大,均高于其余三个证型,Leptin高到低依次为:脾虚痰湿型>肝经郁火型>肾虚型>气滞血瘀型。(5)炎性因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-10的特点:各表型相比:PCOS患者中的IL-6、IL-8炎症因子水平高于对照组女性,且差异均有统计学意义(P<0.05)。其中非高雄型患者IL-6水平最高。IL-4、IL-10水平低于对照组女性,其中非高雄型的PCOS患者的IL-4、IL-10水平差异有统计学意义(P<0.05)。各证型相比:IL-6水平高到低依次为:肝经郁火型>脾虚痰湿型>肾虚型>气滞血瘀型;IL-4高到低依次为:肝经郁火型>气滞血瘀型>肾虚型>脾虚痰湿型。2.实验研究结果:(1)PCOS大鼠模型评价:胰岛素(INS)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)法复制大鼠PCOS模型的大鼠阴道脱落细胞涂片无动情周期改变提示无排卵并显示体重增加、HE病理切片提示卵巢多囊样改变、模型组血清睾酮(T)升高与正常对照组血清水平有显著差异(P<0.05),提示造模成功且符合PCOS的诊断标准。(2)药物干预后各项指标:①体质量比较:加减龙胆泻肝汤药物干预14天后,对PCOS模型大鼠具有明显治疗效果,能降低模型动物体重、卵巢重量及卵巢体积大小(P<0.05)和改善卵巢组织病理形态。②性激素水平:模型组大鼠血清T、LH水平高于正常对照组,与模型组相比,加减龙胆泻肝汤治疗后显著降低PCOS大鼠血清促黄体生成素(LH)、睾酮(T)及胰岛素(INS)水平(P<0.05/P<0.01)。③炎性因子水平:模型组大鼠血清IL-2、IL-6水平高于正常对照组,IL-4、IL-10低于正常对照组,与模型组相比,加减龙胆泻肝汤治疗后升高抑炎因子IL-4、IL-10(P<0.05)和抑制促炎因子IL-2、IL-6水平(P<0.05);WB分析卵巢组织,与正常对照组相比,模型组JAK2和STAT3蛋白表达均升高,加减龙胆泻肝汤各剂量组p-STAT3、IL-6蛋白表达均降低,证实加减龙胆泻肝汤可提高JAK2、STAT3和降低p-STAT3、IL-6的表达量。④血清Leptin、kisspeptin水平:模型组大鼠血清Leptin、kisspeptin水平均高于正常对照组,与模型组相比,加减龙胆泻肝汤各剂量组干预后Leptin、kisspeptin水平降低,高剂量组下降最明显,但和阳性药物组无统计学差异。结论:1.临床研究:①PCOS患者中50%的患者表现出高雄激素血症,其经典型患者的T水平偏高,西医表型中以非高雄型患者居多,其次是经典型患者。中医辨证中肝经郁火型和肾虚型患者常见,其次是痰湿阻滞型和气滞血瘀型。经典型PCOS患者中肝经郁火证的患者较多,非高雄型PCOS患者中肾虚证较多。②不同西医表型和中医证型的PCOS患者的血清炎性因子高于对照组,且促炎因子IL-6水平显著增高,IL-10水平低于对照组。提示了 PCOS患者是一种慢性炎症状态。PCOS患者性激素与其特征性临床表型有直接相关性,其中高T水平与肝经郁火证表型相关,高糖与脾虚痰湿型表型相关,高Leptin与脾虚痰湿证表型相关,而炎症因子则与中医各种表型均相关,它们可能在疾病的发病机制中发挥关键作用。2.实验研究:①胰岛素(INS)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)法复制大鼠PCOS模型,其卵巢病理形态学改变及内分泌改变与临床PCOS患者相似,是理想的PCOS动物模型。②加减龙胆泻肝汤能降低PCOS模型大鼠的体重、卵巢重量及卵巢体积,显著降低PCOS大鼠血清LH、T及胰岛素水平,降低血清Leptin、kisspeptin水平。③加减龙胆泻肝汤治疗后升高抑炎因子IL-4、IL-10(P<0.05)和抑制促炎因子IL-2、IL-6水平,其机制可能与活化JAK2/STAT3通路参与的效应相关。