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研究背景:感染是引起新生儿死亡及严重后遗症的主要原因之一。其中,新生儿细菌性脑膜炎病死率高,即便恢复亦伴发神经系统损伤后遗症,为家庭和社会造成严重的负担。大肠杆菌K1（Escherichia coli K1,E.coli K1）是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体,超过80%患者是由该菌感染所致。外膜蛋白A（Outer membrane A,OmpA）是E.coli K1的关键致病因子,其胞外Loops在E.coli K1抵抗免疫系统的损伤并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染过程中发挥决定性的作用。新生儿感染性肺炎是新生儿期最常见的感染性疾病和重要死亡病因,即使感染控制后亦可造成不可逆损伤,严重影响大脑和身体发育。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是引起新生儿感染性肺炎的三大主要病原菌之一。PA致病因子繁多,其中外毒素A（Exotoxin A,ETA）是PA发现最早、毒力最强、也是最经典的毒力因子。它主要通过细胞识别、跨膜转位和催化活性等过程发挥其细胞的致死效应,在PA引起的新生儿感染性肺炎中发挥重要作用。随着E.coli K1和PA耐药日趋严重,常规抗感染治疗手段已捉襟见肘。因此选择合适的抗体是治疗PA,尤其对耐药PA感染的是有效替代疗法。历史经验证明:疫苗是预防与控制病原菌流行、感染及致病的最佳科学手段;抗体是中和病原菌毒素、治疗感染性疾病的特效药物。若能成功研制针对E.coli K1 OmpA和PA ETA的特异性疫苗或抗体药物,必将有效控制上述细菌的传播和致病。因此本研究针对新生儿常见病原菌Ecoli.K1和铜绿假单胞菌的严峻防控形势,研究新型疫苗和抗体为核心的免疫干预策略和药物,以期为预防新生儿感染的发生、提高其救治水平打下基础。第一部分基于脑膜炎大肠杆菌K1外膜蛋白A胞外功能片段的纳米粒疫苗的研制研究目的:本研究针对新生儿细菌性脑膜炎常见病原菌Ecoli.K1的严峻防控形势,针对其关键毒力因子OmpA研制新型疫苗,以期为预防新生儿Ecoli.K1脑膜炎的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.本课题拟在前期发现Vo抗原具有良好的免疫保护效果的基础上,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（1actide-CO-glycolide）PLGA）和壳聚糖（Chitosan,CS）为辅料,构建包裹Vo的纳米粒疫苗。以复乳溶剂挥发法和直接吸附法制备空白纳米粒,通过检测纳米粒的形态、粒径、分散性指数等重要参数,评价PLGA、丙酮、二氯甲烷及不同修饰方法对纳米粒的影响,筛选出空白纳米粒的最优处方;通过测定不同条件下纳米粒包裹Vo蛋白的包封率,获得最大载药量Vo纳米粒（Vo nanoparticles,VoNP）的最优处方;通过检测VoNP冻干前后的外观、形态学、粒径、电位、物理及化学稳定性等参数的变化,评价冻干工艺对VoNP质量的影响,获得VoNP的最佳制备工艺;按照最佳工艺制备VoNP,通过透射电镜、扫描电子显微镜和原子显微镜,粒度和电位分析仪,质谱仪等考察纳米粒疫苗的基本理化特征及其稳定性。2.以L929国家标准细胞毒性细胞为模型,评价VoNP的体外细胞毒性;以BALB/c小鼠为模型,肌肉注射VoNP后观察心、肝、脾、肺、肾组织病理改变,评价其体内毒性;将VoNP于0,7和14天三次免疫小鼠,检测血清中抗Vo特异性抗体的水平及类型,评价VoNP的免疫原性;致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察小鼠生存率、体重变化情况评价VoNP的保护效果,亚致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察脾、血细菌定植量,初步评价VoNP的免疫保护机制;将制备的VoNP4℃保存180天后按上述方法评价其免疫原性和免疫保护效果,与同样处理的Al（OH）3佐剂吸附的Vo疫苗相比较,评价VoNP长期稳定性。研究结果:1.纳米粒的最适配方为:以丙酮为溶剂壳聚糖修饰的PLGA纳米粒;VoNP的最大载药量为1mg,其包封率为59%;冻干过程（冷冻3h,干燥22小时）对VoNP的形态,粒径和分散性无明显影响;最佳工艺制备的VoNP的平均粒径为250.8±2.13 nm,分散性指数为0.09±0.01,电位为0.6110±0.0267 mV,VoNP呈球状、表面光滑,无明显聚集现象,分散性好;通过MALDI-TOF MS研究证实Vo蛋白在纳米粒疫苗中稳定存在;4℃放置180天的VoNP的粒径、分散性及Zeta电位未发生明显变化,稳定性良好。2.VoNP对L929细胞无明显细胞毒性作用;肌肉注射VoNP的BALB/c小鼠7天内无死亡及不良反应的发生情况,心、肝、脾、肺和肾脏器无明显病理组织学改变,表明VoNP对BALB/c小鼠无明显毒性作用;VoNP免疫小鼠后可引起较强的体液免疫应答反应,且其免疫应答类型以Th2型免疫应答为主。在攻毒保护实验中,VoNP的免疫能通过降低外周血及脾脏中的细菌定植,减轻体重变化等方式抵抗E.coli K1的感染,提高小鼠的生存率。通过动物实验证实长期保存（180天）VoNP不仅具有稳定的理化性质,且其免疫原性和免疫保护效果未见显著变化。表明,VoNP安全性较好,质量稳定。研究结论:本研究成功建立并优化了VoNP的制备工艺,获得了质量稳定、安全性较好的VoNP疫苗,动物实验表明该疫苗具有长期稳定的免疫原性和免疫保护效果,这些发现为进一步成功研发E.coli K1疫苗奠定了基础,并对促进新生儿脑膜炎E.coli K1感染的免疫干预策略研究具有重要的推动作用。第二部分抗外毒素A人免疫球蛋白在铜绿假单胞菌肺炎中的预防和治疗作用研究研究目的:本研究针对新生儿铜绿假单胞菌肺炎治疗的难题,研究以免疫球蛋白为核心的干预策略和药物,以期为预防新生儿PA感染的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.建立以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法,检测320份健康的志愿者血清中ETA特异性抗体浓度;通过Protein A亲和层析法纯化含高效价ETA抗体的免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin,IVIG）;用L929细胞模型评价抗ETA抗体对ETA毒素的中和活性;对BALB/c小鼠腹腔注射抗ETA抗体,后予致死剂量的ETA攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量ETA攻毒小鼠,观察肝脏细胞因子及病理组织改变,探索其保护机制。2.BALB/c小鼠腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,1小时后致死剂量PA103菌气管注射攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;致死剂量PA103菌气管注射攻毒BALB/c小鼠3小时后,腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的治疗效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;将结合GST-ETA的固相载体与纯化得到含高效价抗ETA抗体IVIG共孵育,去除其中ETA特异性IgG,用上述方法评价其毒素中和活性,预防和治疗保护效果的变化,验证其保护效果的特异性。研究结果:1.本研究成功构建了表达ETA及其无毒突变体（mETA）的工程菌株,并纯化得到重组ETA毒素,其活性与天然毒素相当;建立了以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法。检测320名健康志愿者血清中抗ETA抗体水平,发现抗ETA抗体平均浓度为98.7 ng/ml,最高可达918.24 ng/ml。其中血清抗ETA抗体浓度在099 ng/ml约占54%。通过Protein A亲和层析法,成功纯化得到含有高浓度抗ETA抗体的人免疫球蛋白,其SDS-PAGE纯度大于90%。2.通过L929细胞模型发现该抗ETA抗体能有效抑制ETA的细胞毒性,且具有浓度依赖的趋势;通过ETA毒素攻毒小鼠模型发现该抗体可阻断ETA导致的肝脏损伤,从而发挥良好保护效果;在急性PA肺部感染模型上发现,高效价的抗ETA免疫球蛋白可显著降低细菌在肺部的定植和炎症反应,从而发挥预防性及治疗性效应。此外,本研究发现单独使用兔抗ETA抗体或非特异性人IgGs亦可产生有限的保护效果。研究结论:本研究成功从健康的献血者中纯化得到高效价的抗ETA抗体的免疫球蛋白,其具有良好的毒素中和活性。动物实验发现该免疫球蛋白针对ETA毒素和PA急性肺部感染具有良好预防及治疗效果。这些结果为非抗生素预防和治疗PA肺部感染奠定了基础,对PA的防控提供了新的策略和方案,也为其它耐药细菌的免疫干预提供了范例。