目的:非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）是发生在支气管黏膜上皮的肿瘤,其发病率在所有恶性肿瘤中位居第二,死亡率更是排在榜首。现阶段非小细胞肺癌的治疗主要取决于疾病的分期,早期肺癌患者多数选择手术切除,五年生存率高达80%-90%;但晚期患者不能进行手术切除,五年生存率只有15%-20%。尽管针对不同靶点开发的靶向治疗药物发展迅速并明显延长了病人的生存期,但是存在耐药现象等问题的挑战。因此,阐明肺癌发生发展的机制,寻找新的分子诊断标志物和潜在治疗靶点就成为当前研究的重点。课题组前期工作发现,清道夫A类受体5号蛋白（Scavenger Receptor Class A Member 5,SCARA5）是肺癌与癌旁组织中的DNA启动子甲基化存在差异的基因,可望成为潜在的诊断标志物和治疗靶点。本研究将进一步验证其表达差异,并重点探讨SCARA5在NSCLC中的作用与机制。方法:1.非小细胞肺癌中SCARA5的启动子甲基化与基因表达1.1本研究所使用到的数据库、细胞系和肿瘤组织本研究主要使用的数据库有:TCGA数据库、Kaplan-Meier Plotter数据库、Meth HC数据库,通过查询Meth HC数据库,分析SCARA5在肺腺癌（LUAD）、肺鳞癌（LUSC）中的甲基化水平,通过查询TCGA数据库,分析SCARA5在肺癌与癌旁组织中的基因表达水平;通过在线数据库KM Plotter数据库,分析SCARA5对肺癌患者预后的影响。本研究使用的细胞系有人正常肺上皮细胞系BEAS-2B、肺腺癌细胞系A549、肺腺癌细胞系H1299、大细胞肺癌细胞系H460、肺腺癌细胞系H2122和肺小细胞肺癌细胞系H358。所有细胞系均来源于ATCC。通过提取细胞RNA,逆转录为c DNA,检测SCARA5在正常肺上皮细胞与肺癌细胞中的基因表达水平。本研究使用到的肺癌组织样本、配对癌旁组织（经病理鉴定为正常组织）,均来自于重庆医科大学重庆医科大学附属第一医院胸外科。所有的肿瘤样本都有病理学鉴定,肿瘤细胞比例大于70%,并收集了患者的临床病理信息。本研究严格遵守《赫尔辛基宣言》,获得的重庆医科大学附属第一医院机构伦理委员会的批准号为#2016-75。1.2在线数据库分析SCARA5在肺癌中的甲基化水平、基因表达水平及其与预后的关系1)通过下载TCGA数据库中的LUAD与LUSC数据集,查询SCARA5基因探针号,提取癌与癌旁组织表达数据进行分析。2)通过Meth HC数据库下载LUAD与LUSC样本的甲基化数据及配对的基因表达数据,并做甲基化水平与基因表达相关性分析。3)在线数据库KM plotter分析SCARA5表达水平对肺癌患者生存期的影响。4)使用在线数据库Oncominse挑选GEO基因集,再通过GEO数据库下载对应的基因集,通过GSEA初步分析SCARA5影响肺癌预后的可能机制。1.3收集临床样本对在线数据库分析的结果进行验证1)提取64例NSCLC患者癌组织和25例与之配对的癌旁组织DNA,检测SCARA5在肺癌组织及正常肺组织中的DNA甲基化水平。2)在实验室样本库中提取12对NSCLC患者癌组织与癌旁组织总RNA并进行逆转录,检测SCARA5基因在肺癌组织与癌旁组织中的m RNA水平。3)通过重庆医科大学附属第一医院胸外科收集16例NSCLC患者癌组织与16例配对的癌旁组织样本,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,通过免疫组织化学（IHC）检测在肺癌与癌旁组织中SCARA5蛋白水平。4)使用去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza）对肺腺癌细胞系A549和H1299进行处理,检测去甲基化后SCARA5基因表达水平的变化。2.SCARA5在非小细胞肺癌中的作用2.1过表达SCARA5的NSCLC细胞系的构建1)筛选:挑选SCARA5本底表达较低的A549和H1299,转染带有遗传霉素抗性的SCARA5过表达质粒,G418筛选2周,得到SCARA5稳定表达的肺腺癌细胞系,分别用SCARA5-A549和SCARA5-H1299表示,相应的对照组用Vector-A549和Vector-H1299表示。2)验证:提取对照组与过表达组细胞总RNA和蛋白质,分别采用q PCR和WB进行SCARA5表达水平的验证。2.2 SCARA5对NSCLC细胞系体外恶性增殖的影响1)实验对象:A549和H1299细胞系。2)分组设置:SCARA5过表达组（SCARA5-A549和SCARA5-H1299）及其相应的对照组（Vector-A549和Vector-H1299）。3)实验方法:（1）CCK8试剂盒分别检测两组细胞24h、48h和72h的细胞活力。（2）克隆形成试验检测细胞增殖能力。（3）流式细胞术检测细胞周期与凋亡。2.3 SCARA5对裸鼠皮下肺癌移植瘤生长的影响1)动物种类:4周龄免疫缺陷雌鼠（BALB/c-裸鼠）。2)实验分组:Vector-A549（对照组）和SCARA5-A549（过表达组）。3)实验方法:（1）裸鼠皮下注入A549细胞,对照组细胞位于左侧背部,过表达组位于右侧背部。每两天观察并记录瘤体大小。（2）第19天处死小鼠,测量瘤体大小并称重,随后用4%多聚甲醛固定并用石蜡包埋。（3）小鼠移植瘤组织切片,HE染色和免疫组织化学染色检测Ki67。3.SCARA5在非小细胞肺癌中的抑癌机制研究3.1 SCARA5阻滞A549细胞周期的机制探讨1)实验分组:Vector-A549（对照组）和SCARA5-A549（过表达组）。2)检测对象:细胞周期蛋白和激酶的基因表达,包括Cycin B1、CDC25C、CDK1和CHK1。3)检测并比较两组A549细胞中上述细胞周期蛋白和激酶的m RNA、蛋白质水平的变化,再通过生物信息学预测调控它们的转录因子,随后作进一步探究（见3.2）。3.2 SCARA5下调A549细胞系的转录因子FOXM1表达1)上述生信分析结果提示:SCARA5能下调转录因子FOXM1表达。本部分将首先通过检测其m RNA和蛋白质的水平对这一预测结果进行验证。2)再通过荧光素酶报告基因试验进一步验证:在A549细胞中,转录因子FOXM1是否能与其预测的下游靶基因Cyclin B1、CDC25C和CHK1的启动子结合、进而调节这些基因的转录。3)进一步验证SCARA5是通过下调转录因子FOXM1表达、进而下调细胞周期蛋白和激酶来介导其对细胞周期的阻滞作用的:在Vector-A549（对照组）和SCARA5-A549（过表达组）细胞中过表达FOXM1,探讨SCARA5对前述细胞周期蛋白和激酶的抑制作用是否能得到逆转。3.3 SCARA5下调转录因子FOXM1的机制探究1)对Vector-A549及SCARA5-A549组进行转录组测序。2)对上述测序得到的差异基因进行GO分析和KEGG分析,寻找差异基因中与SCARA5抑制NSCLC恶性增殖最相关的基因并进行验证。3)上述GO分析以及KEGG富集分析得到与抑制NSCLC的恶性增殖最相关、变化最显著的基因是热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）家族。本部分将首先对此结果进行表达验证,即检测过表达SCARA5后,A549细胞系中HSP70家族成员的m RNA与蛋白质的表达变化。4)根据KEGG分析结果显示两组的差异基因与内质网功能相关。因此,通过免疫荧光法探究SCARA5蛋白是否与内质网共定位,以进一步明确SCARA5通过影响内质网功能介导下游基因表达的调控。3.4 SCARA5对A549化疗敏感性的影响1)用不同浓度化疗药物5-氟尿嘧啶处理Vector-A549及SCARA5-A549两组细胞,检测药物对细胞增殖抑制率的影响,并计算IC50。2)用中等浓度5-氟尿嘧啶处理Vector-A549及SCARA5-A549两组细胞48小时,通过流式检测细胞凋亡率的变化。结果:1.在NSCLC组织中SCARA5呈启动子高甲基化状态,其m RNA和蛋白质水平低于癌旁组织;SCARA5的表达水平与肺癌患者预后呈正相关。1.1在NSCLC组织中SCARA5启动子甲基化水平明显高于癌旁组织1)查询Meth HC数据库,发现肺腺癌、肺鳞癌组织SCARA5的启动子甲基化水平明显高于癌旁组织（P值均小于0.001）。2)我们对64例临床肺癌组织样本进行检测,发现其中57例存在SCARA5启动子高甲基化（89%）,而25例与之配对的癌旁组织中均未发现SCARA5启动子甲基化（0%）,与数据库预测结果一致。证明在NSCLC中的SCARA5基因启动子甲基化高于癌旁组织。1.2在NSCLC组织中SCARA5基因的表达水平低于癌旁组织1)查询TCGA数据库,发现SCARA5在肺腺癌、肺鳞癌中的表达明显低于癌旁组织（P值均小于0.001）。2)我们通过检测的12对配对临床NSCLC的癌与癌旁组织,发现癌组织SCARA5m RNA表达低于癌旁组织（P<0.01）;多数非小细胞肺癌细胞系的SCARA5表达低于正常肺上皮细胞系BEAS-2B。3)继而,我们通过IHC检测收集的16对配对临床NSCLC的癌及癌旁组织,发现肺癌组织SCARA5蛋白水平低于癌旁组织（P<0.01）。我们验证的结果与数据库预测结果一致,证明SCARA5基因在NSCLC中的表达低于癌旁组织。1.3 NSCLC组织中SCARA5启动子甲基化程度与基因表达水平呈负相关1)分析Meth HC数据库发现,NSCLC肺癌组织SCARA5启动子甲基化与基因表达水平呈负相关（R=0.3121,P=0.0012）。2)使用5-Aza处理A549和H1299细胞系后,SCARA5基因表达上调。证明SCARA5在NSCLC组织的低表达是其启动子的高甲基化所致。1.4 SCARA5表达与肺癌患者预后呈正相关1)在线数据库KM plotter显示,SCARA5表达水平与肺癌患者的预后呈正相关（P < 0.001）。2)GSEA分析提示:SCARA5基因可能参与G2/M期细胞周期阻滞。2.SCARA5抑制NSCLC细胞系的体外增殖和体内生长2.1成功构建过表达SCARA5的A549和H1299细胞系。qPCR和Western Blot结果显示,过表达的稳定细胞系SCARA5-A549和SCARA5-H1299细胞中,SCARA5的表达水平明显高于对照组,提示稳定过表达细胞系构建成功。2.2 SCARA5抑制NSCLC细胞系A549和H1299的体外恶性增殖CCK8和克隆形成试验结果:SCARA5-A549和SCARA5-H1299组的细胞活力和单个细胞增殖能力均明显低于对照组（P值均小于0.01）。2.3 SCARA5诱导NSCLC细胞系凋亡与细胞周期阻滞SCARA5-A549和SCARA5-H1299组的细胞凋亡数目（包括早期凋亡和晚期凋亡）均较对照组明显增加（P值均小于0.001）,同时它们的细胞周期均被阻滞,其中SCARA5-A549细胞阻滞于G2/M期,SCARA5-H1299细胞阻滞于S期（P值均小于0.05）。2.4 SCARA5抑制NSCLC细胞系A549的裸鼠皮下成瘤1)在SCARA5-A549组中,裸鼠皮下瘤的大小和重量均明显低于对照组（P< 0.001）。2)HE染色结果显示,SCARA5-A549组肺癌细胞核深染增加、不规则核形态增多,即凋亡细胞增加,提示其诱导细胞凋亡;同时,其Ki67阳性细胞比例降低,即其细胞增殖能力低于对照组。本部分结果一致表明SCARA5能抑制NSCLC的体外增殖和体内生长;其抑制机制包括诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期。3.SCARA5通过抑制FOXM1表达继而抑制A549细胞的G2/M细胞周期蛋白和激酶的表达,由此介导G2/M细胞周期阻滞3.1 SCARA5抑制A549细胞的G2/M细胞周期蛋白和激酶的表达。1)SCARA5-A549组的Cyclin B1、CDK1和CDC25C蛋白及其相应的m RNA水平均低于对照组（P值均小于0.05）。2)SCARA5-A549组的DNA损伤标志物γ-H2AX上调,但CHK1蛋白和m RNA水平则下调（P<0.001）。3)Venn图显示:通过分析GEO数据集GSE12667得到292个差异基因。其中,FOXM1和FOS1是调控Cyclin B1、CHK1和CDC25C表达的共同转录因子,提示SCARA5可能通过调控FOXM1和FOS1的表达进而抑制细胞周期蛋白和激酶的表达（相关验证结果见3.2）。3.2 SCARA5通过抑制转录因子FOXM1表达从而阻滞细胞周期进程。1)SCARA5-A549组的FOXM1 m RNA和蛋白表达水平明显低于对照组（P<0.01）;2)荧光素酶报告试验结果显示,FOXM1能与CDC25C和Cyclin B1的启动子结合（P<0.05）。3)过表达FOXM1能使SCARA5-A549组的细胞周期蛋白Cyclin B1、CDC25C和CHK1蛋白水平得到逆转。上述实验结果提示SCARA5可抑制转录因子FOXM1的表达、进而下调细胞周期蛋白Cyclin B1、CDC25C和CHK1的表达,并通过此机制介导其对A549细胞G2/M周期的阻滞作用。4.SCARA5转位于内质网并诱导HSP70表达上调4.1 SCARA5蛋白与内质网共定位1)转录组测序发现:在A549细胞系中过表达SCARA5后有509个基因上调,310个基因下调。2)GO分析显示509个上调的差异基因主要与非折叠蛋白反应（UPR）相关。3)KEGG分析509个上调的差异基因,结果表明上调的差异基因与内质网功能（ER）相关。4)免疫荧光检测证实SCARA5蛋白与内质网共定位。本部分结果提示在A549细胞中,SCARA5能与内质网结合,并可能因此介导UPR。4.2 SCARA5诱导HSP70家族蛋白表达上调1)在509个上调基因中,与GO分析、KEGG分析结果相关联的差异基因是HSP70家族蛋白。2)通过q PCR和Western Blot进行验证,我们发现HSP70家族成员中的HSPA1A、HSPA1B和HSPA5表达上调。本部分结果提示SCARA5能诱导A549细胞HSP70家族蛋白表达上调。因为HSP70是UPR过程的主要效应蛋白,再结合4.1的结果,因此我们推测SCARA5上调HSP70的机制可能与SCARA5蛋白定位于内质网、继而介导UPR的产生相关。5.SCARA5增加NSCLC细胞系A549对DNA损伤类的化疗药物的敏感性1)在不同浓度的药物5-FU、Cisplatin和Gemcitabine处理后,SCARA5-A549组的细胞增殖抑制率均高于对照组（P值均小于0.05）,IC50均低于对照组。2)在同一浓度药物5-FU处理后,SCARA5-A549组的凋亡率明显高于对照组（P<0.001）。本部分结果证明SCARA5可增强肺癌细胞系A549对化疗药物的敏感性,可能作为潜在的与化疗药物联合用药的治疗靶点。结论:1.SCARA5在NSCLC中表达下调,其主要机制是基因启动子区的高甲基化;SCARA5在肺癌中的表达水平与肺癌患者预后正相关。2.SCARA5能抑制NSCLC体内生长和体外增殖,呈抑癌基因的表现;该抑制作用与其促进细胞凋亡和诱导细胞周期阻滞相关。3.SCARA5通过抑制FOXM1表达继而抑制A549细胞的G2/M细胞周期蛋白和激酶的表达,由此介导G2/M细胞周期阻滞。4.SCARA5与内质网发生共定位,并诱导HSP70表达上调。SCARA5上调HSP70的机制可能与其定位于内质网继而介导UPR的产生相关。5.SCARA5增强NSCLC对DNA损伤类的化疗药物的敏感性。上述提示,SCARA5基因的启动子甲基化水平可能成为NSCLC预后判断的潜在标志物,而SCARA5基因本身则可能是联合化疗药物治疗NSCLC的一个潜在靶点。