沙门菌（Salmonella）是一种在自然界中分布广泛的病原菌,可导致人类和畜禽的多种疾病,其宿主谱十分广泛。鸡白痢（Pullorum Disease,PD）是由鸡白痢沙门菌（Salmonella Pullorum）引起的一种鸡的全身性疾病。临床表现为精神萎顿、腹泻、厌食、产蛋下降等症状,2～3周龄以内雏鸡的病死率可达100%。感染该菌的成鸡可终身带菌,并且可经卵垂直传播。该菌对养禽业影响巨大,我国将净化种鸡场沙门菌病列入《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》。对鸡白痢沙门菌致病机理的研究,有助于实现我国防控鸡白痢的目标,具有十分重大的意义。沙门菌是一种兼性胞内寄生菌,其在巨噬细胞内的存活能力严重影响该菌在致病过程中的作用发挥,但该菌抗巨噬细胞清除的相关机制尚需深入研究。PhoP激活基因C（PhoP-activated gene C,pagC）编码的蛋白位于细胞膜上。pagC基因受到PhoP/PhoQ双组分系统调控,影响沙门菌在巨噬细胞内的存活能力。前期研究显示,pagC基因可促进鸡白痢沙门菌产生胞外囊泡（Outer Membrane Vesicles,OMVs）,并进一步影响细菌生物被膜的形成。在此基础上,本研究以鸡巨噬细胞HD11作为细胞模型,研究pagC基因对鸡白痢沙门菌CVCC1800胞内存活能力及致病力的影响,并希望利用Tn-seq技术筛选鸡白痢沙门菌感染巨噬细胞过程相关的功能基因,为进一步阐明鸡白痢沙门菌的致病机理提供参考。1pagC基因对鸡白痢沙门菌在巨噬细胞内存活能力的影响本文对鸡白痢沙门菌CVCC1800在HD11细胞内的存活特性进行了初步研究。通过比较在37℃和42℃条件下CVCC1800株在HD11细胞内的存活情况,发现37℃条件下沙门菌胞内存活数显著高于42℃;通过对感染后不同时间点胞内沙门菌及对照组大肠杆菌计数发现,鸡白痢沙门菌可在HD11细胞内存活至少24h,而大肠杆菌在感染后20 h已被完全清除;HD11细胞感染鸡白痢沙门菌CVCC1800后,显微镜观察可见胞内巨大囊泡样结构。吞噬体内的酸性环境会刺激沙门菌激活PhoP/PhoQ双组份系统。PhoP 激活基因 C（PhoP-activated gene C,pagC）受 PhoP/PhoQ双组份系统调控,在鸡白痢沙门菌抗巨噬细胞清除过程中发挥作用。本文通过比较野生株、pagC基因缺失株及质粒回补株在巨噬细胞内的存活情况,发现细菌感染细胞20 h时pagC基因缺失株的细菌载量为2h时的5.42倍,而野生株及回补株的细菌载量为2 h时的1.89和1.81倍。以上研究初步证实pagC基因可抑制鸡白痢沙门菌在HD11细胞内的存活能力。2pagC基因对鸡白痢沙门菌CVCC1800致病力的影响前期工作表明鸡白痢沙门菌pagC基因缺失株在胞内的存活能力较野生株显著提高,pagC基因的这种特性可能会进一步影响鸡白痢沙门菌对雏鸡的致病力。本研究使用鸡白痢沙门菌CVCC1800野生株、pagC基因缺失株及回补株,通过灌胃及肌注的途径接种新生白羽肉鸡。攻毒120h内测量雏鸡体重并描绘体重曲线,结果表明,经肌注攻毒pagC基因缺失株会造成新生雏鸡体重减轻,而野生株较空白对照组差异不显著;死亡曲线也同样表明肌注pagC基因缺失株组雏鸡的死亡率为100%,而野生株组未观察到雏鸡死亡;病理切片显示肌注pagC基因缺失株组雏鸡盲肠病变更加严重,出现粘膜上皮脱落,炎性细胞浸润等现象;组织细菌载量测定结果表明,缺失株在雏鸡卵黄中的细菌载量为回补株组的10.41倍。本研究证实pagC基因可以降低细菌对雏鸡的致病力。3鸡白痢沙门菌pagC基因缺失株及野生株转座子突变体库的构建及筛选为了进一步研究CVCC1800株在巨噬细胞内存活机制,鉴定该菌与pagC相关的巨噬细胞内存活所需的基因,本研究使用mariner转座子通过接合转导的方式,分别以鸡白痢沙门菌CVCC1800野生株及pagC基因缺失株为亲本,构建了包含106个转座子突变体的Tn-seq突变体库。对CVCC1800野生株突变体库进行测序,分析结果表明转座子突变体库构建成功,且筛选到312个必需基因,为后续毒力基因筛选奠定了基础。另外分析还发现,在构建鸡白痢沙门菌CVCC1800转座子突变体库的过程中,质粒pSPI12上存在mariner转座子的插入热点,88%的插入均发生在该质粒上。该现象使文库的丰度降低,影响分析的准确性。后续的工作需先将该质粒从菌体中去除,才能获得高质量的文库,用于进一步对细菌在巨噬细胞内存活相关的毒力基因进行筛选分析。