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研究背景和目的:皮肤创面难愈是糖尿病最常见和致残率高的慢性并发症之一。血管新生是伤口愈合过程中的一个关键步骤,它可为损伤区带来氧气和营养物质,以促进创面细胞增殖、再上皮化和胶原再生。然而,糖尿病患者的血管新生能力常常降低,以致伤口迁延不愈。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是成熟内皮细胞的天然祖细胞,研究证实EPCs移植可促进糖尿病动物皮肤缺损处血管新生和伤口闭合。新近研究发现移植细胞主要通过旁分泌机制发挥其治疗功能,而外泌体是其中一种重要的旁分泌因子,可独立地作为一种生物活性成分应用于组织再生。目前较少有关于外泌体修复糖尿病难愈创面的研究报道。鉴于EPCs强大的促血管新生和皮肤损伤修复功能,我们推测EPCs分泌的外泌体(EPCs derived exosomes,EPC-Exos)很可能具有促进皮肤缺损处血管新生和创伤愈合的功能。为此,我们探究了EPC-Exos对糖尿病大鼠皮肤损伤的修复功能和作用机制,以期为糖尿病难愈创面的治疗提供一条新策略。方法:1.人脐血来源EPCs的分离培养和鉴定1.1 EPCs的分离培养:采用经典的密度梯度离心法分离人脐血中的单个核细胞,并采用EGM-2MV完全培养基选择性培养出EPCs。1.2 EPCs的鉴定:普通光学显微镜下观察细胞形态;免疫荧光和流式细胞术鉴定EPCs表面标志;体外检测EPCs在Matrigel表面成血管的能力;通过荧光染色检测EPCs摄取Di L-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力。2.EPC-Exos的收集与鉴定2.1 EPC-Exos的收集:采用经典的超速离心法结合超滤法从EPCs的条件培养基中提取其分泌的外泌体即EPC-Exos。2.2 EPC-Exos的鉴定:透射电子显微镜下观察EPC-Exos的形态;可调电阻脉冲感应技术(tunable resistive pulse sensing,TRPS)分析EPC-Exos的直径和浓度;Western技术检测EPC-Exos的表面标志物。3.EPC-Exos对糖尿病大鼠皮肤损伤的修复作用3.1建立糖尿病大鼠皮肤损伤模型,局部多点注射不同浓度的EPC-Exos(2×1010或1×1011 particles,200μL PBS溶解)或等体积的PBS。3.2于移植后第4、7和14天观察创面愈合情况并计算伤口闭合率。3.3于移植后第14天行HE染色观察创面上皮化和疤痕形成情况,比较各组上皮化百分率和疤痕宽度;Masson染色观察创面胶原再生情况。4.EPC-Exos对糖尿病大鼠皮肤损伤处血管新生的影响4.1于移植后第14天切取各组创面并将内面翻转朝上,观察创面血管形成情况。4.2利用Micro-CT联合Microfil灌注技术观察创面血管形成情况。4.3采用CD31和α-SMA免疫荧光染色观察创面血管新生和成熟情况。5.EPC-Exos调控血管新生的机制5.1将Di O绿色荧光探针标记的EPC-Exos与人微血管内皮细胞(Human microvascular endothelial cells,HMECs)共培养,在荧光显微镜下观察HMECs对EPC-Exos的摄取情况。5.2通过CCK8增殖实验、Matrigel表面成管实验和划痕实验分别检测不同浓度EPC-Exos对HMECs增殖、成管和迁移能力的影响。5.3通过基因表达谱芯片技术和生物信息学分析检测EPC-Exos作用后HMECs中差异表达的基因和主要影响的信号通路。5.4通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)和western明确EPC-Exos对Erk1/2信号通路相关基因和蛋白表达的调节作用。5.5将Erk1/2信号通路的选择性抑制剂U0126作用于HMECs,观察EPC-Exos对HMECs基因和蛋白的表达、增殖、成管和迁移功能的调控作用是否消失。结果:1.成功从人脐血中分离培养出EPCs:EPCs克隆一般在培养后7-10天出现,呈典型血管内皮样形态、“铺路石”状排列;免疫荧光和流式结果显示,EPCs高表达CD31、CD34、CD133、v WF、VEGFR-2和VE-cadherin,不表达CD45;功能实验结果显示,EPCs具有在Matrigel表面成管、摄取Di L-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力。2.成功从EPCs的条件培养基中收集到EPC-Exos:EPC-Exos在电镜下呈形态基本一致的圆形或椭圆形;TRPS分析结果显示EPC-Exos的直径主要集中在50-60nm;Western结果显示EPC-Exos表达经典外泌体表面标志CD63、CD81和CD9分子,并表达内皮谱系标志物CD31。3.EPC-Exos可促进糖尿病大鼠皮肤伤口的愈合3.1在术后第4、7、14天,EPC-Exos移植组皮肤伤口的闭合速度比对照组加快,且随着EPC-Exos浓度的升高,其促皮肤伤口愈合的作用明显增强。3.2 HE染色和Masson染色结果显示,在术后第14天,EPC-Exos移植组皮肤伤口上皮化和胶原形成的程度高于对照组,而疤痕形成减低,且高浓度EPC-Exos的促上皮化、胶原再生和抑制疤痕形成的作用更明显。4.EPC-Exos可促进糖尿病大鼠皮肤伤口处血管新生4.1在术后第14天,对照组大鼠皮肤伤口处血管稀少,而EPC-Exos移植组皮肤伤口处血管数目明显增多,且EPC-Exos浓度增大后,血管增多更明显。4.2基于Micro-CT的血管造影结果显示,EPC-Exos移植后可显著增加大鼠皮肤伤口处新生血管的数目,且高浓度EPC-Exos促血管生成作用更为显著。4.3免疫荧光染色显示,EPC-Exos移植组皮肤创面的CD31阳性和CD31/α-SMA双阳性的细胞数明显增多,且高浓度EPC-Exos移植组皮肤伤口处阳性细胞增多更为显著,表明EPC-Exos可促进皮肤损伤区的血管新生和成熟。5.EPC-Exos通过激活Erk1/2信号通路增强HMECs的成血管功能5.1 Di O标记的EPC-Exos可被HMECs摄取,且多聚集在HMECs的细胞核周围。5.2 EPC-Exos可增强HMECs的增殖、迁移和成管能力,且高浓度EPC-Exos对其功能的促进作用更明显。5.3芯片数据显示,EPC-Exos作用后一系列与Erk1/2信号通路相关的成血管基因(FGF2、IL-6、IL-8、c-Myc、Id1、Cox-2、VEGFA和CCND1)显著上调。5.4 q RT-PCR和western结果证实,EPC-Exos作用后Erk1/2信号通路下游靶分子(c-Myc、Id1、Cox-2和VEGFA)的基因和蛋白水平以及Erk1/2的磷酸化程度均明显升高。5.5采用U0126作用HMECs后,EPC-Exos对HMECs基因和蛋白的表达、增殖、成管和迁移功能的调控作用均消失。结论:1.局部移植EPC-Exos可提高糖尿病大鼠皮肤伤口愈合率,增强新生血管形成、表皮和胶原组织再生。2.EPC-Exos可通过激活Erk1/2信号通路增强HMECs的增殖、迁移和成管能力。