目的:人类慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）起源于肾小球,它是形成原发尿的过滤器,肾小球选择性过滤过程很大程度上取决于足细胞的结构完整性和功能能力。足细胞表面核心蛋白nephrin是其中央信号平台,发挥信号传递作用。越来越多证据表明维生素D及其类似物发挥独立于钙磷代谢之外的肾保护作用,其对足细胞作用的报道较少,以及足细胞损伤的机制还没有定论。所以,我们探究活性维生素D₃（Active Vitamin D₃,AVD₃）对足细胞损伤和PI3K/Akt通路的影响,挖掘其发挥作用的潜在机制。方法:1.健康6周龄雄性SD大鼠随机分为正常对照组（NC）、阿霉素肾病模型组（AN）、阿霉素肾病活性维生素D₃（0.25μg/kg/d）干预组（AN+AVD₃）,每组36只。造模大鼠（AN、AN+AVD₃组）单次尾静脉注射阿霉素（adriamycin,ADR,7.5 mg/kg）,以大量蛋白尿、肾功能障碍以及肾病理损伤为实验标准,实验时长达10周。每2周测定各组大鼠不同时期内各项指标,包括:体重、肾脏系数、肾功能指标、肾病理损伤;免疫荧光观察nephrin、desmin、PI3K（p85α）及p-Akt在肾小球中的定位,免疫组织化学半定量和Western Blot定量分析nephrin、desmin、PI3K（p85α）、AKT及p-Akt蛋白表达水平,实时荧光定量PCR（qPCR）检测nephrin、desmin、PI3K（p85α）及总AKT mRNA水平。2.体外培养的大鼠足细胞分为:对照组（Control）、单纯1a,25-二羟维生素D₃组（10nmol/L,AVD₃）、ADR足细胞损伤模型组（1.5μmol/L,ADR）和1a,25-二羟维生素D₃干预组（1.5μmol/L ADR+10 nmol/L AVD₃,ADR+AVD₃）;大鼠形态学,免疫荧光鉴定大鼠足细胞;MTT法检测ADR对足细胞细胞活力的抑制作用,AVD₃对足细胞细胞活力的保护效应;Western Blot检测不同浓度ADR、AVD₃对nephrin蛋白表达的影响;Western Blot检测AVD₃对ADR刺激下损伤足细胞desmin、nephrin、PI3K（p85α）、总AKT及p-Akt蛋白表达的影响。结果:第一部分:活性维生素D₃对AN大鼠足细胞损伤和PI3K/Akt通路的影响1.1 AN大鼠模型评价与NC组比,造模组（AN、AN+AVD₃）大鼠出现一般体征和精神异常:毛色蓬乱暗黄、多尿便稀、喜蜷缩、易激惹;造模大鼠产生大量蛋白尿（>30 mg/100g）和肾表型异常:肾小囊囊腔增宽、基底膜增厚、肾小管上细胞脱落及肾间质炎性浸润等。1.2 AVD₃对AN大鼠肾保护作用与同期NC组比,AN组大鼠体重显著降低（P<0.05）,肾脏指数、24h尿蛋白（24h UP）、显著升高（P<0.05）,肾功能指标:血清总蛋白（total serum protein,TP）和白蛋白（albumin,Alb）降低（均P<0.05）,肌酐（creatinine,Cre）和总胆固醇（total cholesterol,TC）升高（均P<0.05）,肾病理染色显示系膜基质指数及纤维化面积百分比显著升高（均P<0.05）,AN+AVD₃组大鼠体重不同程度升高、肾脏系数降低、蛋白尿减少、TP及Alb水平升高、Cre及TC水平降低、系膜基质指数和纤维化面积百分比降低（均P<0.05）。1.3 AVD₃对AN大鼠的nephrin、desmin、PI3K（p85α）及p-Akt的影响免疫荧光显示nephrin、desmin、PI3K（p85α）及p-Akt蛋白均定位与肾小球内,免疫组织化学染色和Western Blot检测显示AN组大鼠肾皮质nephrin蛋白表达水平降低（P<0.05）,desmin、PI3K（p85α）及p-Akt蛋白水平均显著升高（均P<0.05）,同时进一步qPCR实验结果与蛋白结果一致;AVD₃治疗促进nephrin蛋白及mRNA水平表达（P<0.05）,降低desmin、PI3K（p85α）蛋白及mRNA水平（均P<0.05）,而各组总的AKT在蛋白与mRNA水平上未见差异（均P>0.05）。1.4足细胞损伤与蛋白尿的生成密切相关Spearman相关分析表明,AN大鼠的nephrin表达和足细胞损伤呈负相关（r=-0.4938,P<0.05）,同时,与24h UP呈负相关（r=-0.4588,P<0.05）;desmin蛋白表达与24h UP呈正相关（r=0.8165,P<0.01）。第二部分:活性维生素D₃可能通过nephrin-PI3K/Akt通路减轻足细胞损伤2.1体外大鼠足细胞鉴定未分化的足细胞呈鹅卵石样外观,未见明显足突,分化成熟的足细胞呈纤维细胞样,中间凸起,两端细长;免疫荧光染色显示该细胞系表达足细胞WT-1、nephrin蛋白,可见,该细胞系来源足细胞,为后续实验开展奠定基础。2.2 ADR及AVD₃干预对细胞活力的影响采用不同浓度,不同时间刺激足细胞,MTT法检测细胞的活力显示,ADR对细胞的活力抑制作用随浓度、刺激时间呈依赖性降低,1.5μmol/L ADR刺激足细胞对细胞活力有显著抑制作用（P<0.05）,为对照组的64.21%;在此条件下诱导足细胞损伤,活性维生素D₃干预,细胞活力呈浓度依赖性升高,且10 nmol/L干预浓度对细胞活力有显著保护效应（P<0.05）,nephrin蛋白表达检测获得与之一致结果。2.3 AVD₃对足细胞nephrin、desmin、PI3K（p85α）、AKT及p-Akt蛋白表达影响与Control组比,ADR刺激下足细胞nephrin表达降低（P<0.05）,desmin、PI3K（p85α）及p-Akt表达升高（均P<0.05）,AVD₃干预促进nephrin表达（P<0.05）,抑制desmin、PI3K（p85α）及p-Akt表达（均P<0.05）,总AKT蛋白表达在各组间均无统计学意义（均P>0.05）。2.4 nephrin与PI3K/Akt信号通路相关性分析Spearman相关性分析显示:ADR诱导的大鼠足细胞损伤模型中,nephrin蛋白表达与PI3K/Akt通路蛋白呈明显负相关（r=-0.6082,-0.3671;均P<0.05）,免疫荧光双标显示在肾皮质肾小球中nephrin蛋白与PI3K/Akt通路蛋白存在共表达。结论:1.在阿霉素肾病足细胞损伤模型中,nephrin表达降低,且与24h尿蛋白存在相关性,提示足细胞损伤是CKD产生蛋白尿的重要原因。2.从动物肾病模型及足细胞损伤模型实验表明,活性维生素D₃促进nephrin表达,改善肾功能,提示足细胞是活性维生素D₃发挥肾脏保护作用的靶器官。3.活性维生素D₃抑制ADR诱导PI3K/Akt信号通路激活,且nephrin表达与PI3K/Akt信号通路激活存在相关性,提示nephrin-PI3K/Akt信号通路是活性维生素D₃发挥肾保护作用的潜在分子机制。